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头颈部鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck,SCCHN)被世界公认为第六大肿瘤,在世界范围内每年报道50多万新增病例。喉痛是呼吸道第二大常见恶性肿瘤,占所有恶性肿瘤的2％～3％,在我国,特别是东北地区,喉癌的发病率呈逐年上升趋势。早期喉癌通常以单纯放疗或手术切除为主,对于进展期喉癌,在世界范围内,全喉切除术仍然是首选的治疗方法。5-氮杂胞苷(5-azacytidine)或5-脱氧氮杂胞苷(5-aza-deoxy-cytidine,5AZA-CDR)是DNA甲基转移酶抑制剂。5-氮杂胞苷通过降低基因启动子区域的甲基化程度,使某些因启动子区被甲基化而失活的肿瘤抑制基因被重新激活,可达到治疗肿瘤的目的。
前期,我们利用二维电泳(TWO dimensional electrophoresis,2-DE)和质谱技术对经5-Aza-CdR处理前后的喉癌Hep-2细胞系进行筛查,鉴定出若干表达差异蛋白如14-3-3epsilon等。14-3-3epsilon参与多种生物过程如细胞周期、细胞增殖以及细胞凋亡等的调控,并且在神经发生以及恶性肿瘤形成的过程中具有重要的作用。
目前,14-3-3epsilon在喉癌发生中的功能以及调节机制并不十分清楚,因此,本研究将通过对14-3-3epsilon在LSCC中的表达及生物特性的分析,探讨14-3-3epsilon在喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,Lscc)的发生和发展中的作用。
材料与方法
以喉鳞癌组织标本为实验材料,应用RT-PCR和Western Blot检测喉鳞癌组织中14-3-3epsilon基因的表达水平,应用统计学方法分析临床资料与14-3-3epsilon表达水平之间的关系。
构建14-3-3epsilon.GFP表达载体,转染喉癌细胞系Hep-2,通过荧光显微镜和RT-PCR观察并检测转染前后Hep-2细胞中14-3-3epsilon基因表达水平。应用MTT、流式细胞术、Transwell分别检测过表达14-3-3epsilon基因对Hep-2细胞增殖能力、细胞周期、细胞凋亡水平以及体外侵袭能力等生物学特性的影响。
实验结果
1、在喉癌组织中,14-3-3epsilon mRNA及蛋白质表达水平明显低于癌旁对照组织;14-3-3epsilon蛋白质在转移淋巴结中的表达水平较喉癌组织中的表达水平更低;14-3-3epsilon蛋白质在喉癌临床Ⅲ期或Ⅳ期癌组织中的表达水平明显低于在I期或Ⅱ期癌组织中的表达水平。
2、构建重组表达载体14-3-3epsilon-GFP,经双酶切及菌液测序检测,结果准确无误。
3、与空白对照组相比,在转染GFP组及14-3-3epsilon-GFP组中,Hep-2活细胞的百分数分别为71.68±12.10％和36.68±14.09％(P<0.05)。
4、空白对照组、转染GFP组和转染14-3-3epsilon-GFP组中,Hep-2细胞处于细胞周期S期的百分数分别为22.47±3.36％,28.17±3.97％和46.15±6.82％(P<0.05),处于凋亡亚G1期的百分数分别为1.23±1.02％,2.92±1.59％和13.72±3.89％fP<0.05)。
5、在空白对照组、转染GFP组和转染14-3-3epsilon-GFP组中,晚期凋亡细胞的百分数分别为0.84±0.25％,1.08±0.24％以及2.93±0.13％(P<0.001)。
6、在空白对照组、转染GFP组以及转染14-3-3epsilon-GFP组中,穿过Transwell小室滤膜的细胞数分别为20.65±1.94,17.63±1.04以及9.1±0.24(P<0.001)。
结论：1、14-3-3epsilon在喉癌中的低表达促进了喉癌的发生及进展。2、14-3-3epsilon在喉癌中具有促进癌细胞凋亡以及抑制癌细胞侵袭的能力。