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拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）是我国南方沿海的一种重要的经济养殖蟹类。随着养殖规模的扩大，养殖密度的增加，以及水质环境的恶化，青蟹养殖的相关疾病频发，严重影响了青蟹养殖产业的可持续发展。目前，对拟穴青蟹相关免疫机制的研究还处于初步阶段，血淋巴是宿主免疫应答的重要场所且其中存在很多潜在致病菌的微生物，因此研究拟穴青蟹血淋巴响应副溶血弧菌感染的稳态机制，对于控制拟穴青蟹疾病具有重要意义。本文对拟穴青蟹血淋巴微生物丰度，组成及动态平衡的免疫调控机制进行初步研究，所获结果如下： 1.研究利用微生物纯培养技术和滤膜过滤法研究血淋巴微生物的丰度及其多样性数据。通过滤膜计数血淋巴微生物丰度为2.59×104cells/mL，16SrRNA高通量测序分析发现：Escherichia-Shigella、盐单胞菌属(Halomona)、Pelagibacterium、不动杆菌属(Acinetobacter)占绝对优势，而通过平板计数血淋巴微生物丰度只有1.57×102CFU/mL，可培养菌群主要是黄杆菌属(Tenacibaculum)、弧菌属(Vibrio)、希瓦氏菌属(Shewanella)、不动杆菌属(Acinetobacter)。结果表明通过滤膜过滤法获得的青蟹血淋巴丰度显著高于平板菌落计数，微生物群落组成偏差也更小。 2.在拟穴青蟹转录组数据库中得到两种DUOX基因，利用RACE技术克隆DUOX全长序列，预测SpDUOX1cDNA序列全长为4786bp，开放阅读框(openreadingframe，ORF)长4494bp，共编码1497个氨基酸，SpDUOX1是一个6次跨膜蛋白，胞外域包含20个氨基酸信号肽序列，526个氨基酸过氧化物酶同源结构域(Pemxidasehomologydomain，PHD)；胞内域包含三个EF结构域(calciumbindingregiondomains)，104个氨基酸的黄素腺嘌呤二核甘酸(Flavinadeninedinucleotide,FAD)结合结构域和157个氨基酸的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)结合结构域，预测SpDUOX2cDNA序列全长为5093bp，ORF长4713bp，编码1570个氨基酸。SpDUOX2是一个7次跨膜蛋白，胞外域包含一个N端23个氨基酸信号肽序列，552个氨基酸的过氧化物酶同源结构域；胞内域包含三个EF结构域，101个氨基酸的黄素腺嘌呤二核甘酸结合结构域和154个氨基酸的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合结构域。通过系统进化分析表明，SpDUOX1与日本囊对虾的MjDUOX(BAM76968)相似性最高，达84.6%，SpDUOX2则与日本囊对虾的MjDUOX(ANA91274.1)相似性最高，为55.7%，而SpDUOX1和SpDUOX2的相识度仅为28%。qPCR结果显示SpDUOX1和SpDUOX2在各组织中均有表达，其中两者在肝胰腺中表达都较高。同时在副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、脂多糖(lipopolysaccharide)胁迫下，血淋巴和肝胰腺组织在6h均出现上调表达。 3.利用RNA干扰敲降SpDUOX后，与对照组相比SpDUOX1和SpDUOX2干扰组的过氧化氢都显著下调；而血淋巴微生物都显著上升。且血淋巴对外来致病菌清除能力减弱，其中SpDUOX2敲降后血淋巴微生物有更显著变化，高通量测序表明：SpDUOX2敲降后血淋巴中噬氢菌属(Hydrogenophaga)、希瓦氏菌属(Shewanella)、海单胞菌属(Marinomonas)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)等显著上升，表明SpDUOX可通过调控过氧化氢从而参与维持血淋巴微生物动态平衡。 综合以上结果，本论文通过对拟穴青蟹血淋巴微生物的丰度、组成及SpDUOX参与维持血淋巴微生物动态平衡调控机制进行初步分析，进一步为研究血淋巴菌群在拟穴青蟹先天性免疫防御中的作用奠定了基础。