纳米抗体因其具有的独特优势，近年来在肿瘤诊断治疗、生物技术和食品安全等领域取得了较大进展并具有良好的应用前景，这就要求它具有更高的亲和力。同时，纳米抗体独特的空间结构使其易于在体外进行亲和力成熟。由于本实验室前期研究获得的来源于合成文库的抗CD47特异性纳米抗体(VHH2)三维结构
　　未知，且亲和力较低，限制了进一步的应用。故而在本研究中，我们探究了同源建模所得纳米抗体三维结构应用于体外亲和力成熟及亲和力提高的分子机理。
　　首先以5个序列同源的纳米抗体晶体结构为模板，利用Modeller软件构建了50个初始的同源结构模型，通过molpdf、DOPE及GA341函数评价并选择了一个最佳的三维结构模型；随后利用拉氏构象图法进行了评估。结果表明，该模型结构合理。通过分子动力学模拟进行结构优化及能量最小化，为后续实验提供了可靠的初始结构。其次以CD47胞外段区域(CD47ext)为抗原，通过分子对接获得了抗原抗体复合物的结构，并通过Hotspots、InterProSurf等方法确定了VHH2的抗原结合位点。随后以这些位点为基础，构建单点及多点突变，并通过SIE-SCWRL、FOLDX及Rosetta等三种打分函数进行评价计算，最终得到7个亲和力提高的多点突变体(M1～M7)。然后通过Rosetta-gami及TransB氧化型突变大肠杆菌在胞内表达目的蛋白，亲和纯化后产量最高为3.845mg/L；之后通过SPR及qPCR验证突变体的亲和力常数KD及TM值，其中M7亲和力高达3.18nM，且TM提高7.36℃。同时对VHH2及最佳突变体M7进行了间接ELISA验证实验，证明其具有良好的结合活性及热稳定性。最后借助PICServer及PyMol预测相互作用，从分子水平解析M7亲和力及热稳定性提高的分子机理，发现疏水性相互作用、离子相互作用等新生成的相互作用力有利于亲和力的提高，且芳香族氨基酸同时对亲和力及热稳定性影响较大。
　　本文构建了抗CD47特异性纳米抗体的同源三维结构，首次将同源建模结果引入纳米抗体的体外亲和力成熟过程，并最终得到亲和力提高87.4倍(TM提高7.36℃)的突变体，为构建纳米抗体的快速体外亲和力成熟平台奠定了基础。此外，本文分析突变体亲和力提高的分子机理，证实了芳香族氨基酸对于亲和力及热稳定性的双重影响，对于纳米抗体等小分子抗体的设计及亲和力成熟具有一定借鉴意义。