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研究背景:胰腺癌(PDAC)是消化道肿瘤中恶性程度很高的肿瘤,是世界范围内的高致死率疾病。胰腺癌早期症状隐匿且疾病进展快,而手术切除和化疗有效率低,患者预后极差。急需研究胰腺癌的发病机制、开发免疫治疗新方法。microRNA(miRNA)是可以调控与肿瘤生长、侵袭和免疫逃避相关的非蛋白编码RNA。但是,有关miRNA对胰腺癌免疫的调控作用知之甚少。因此,miRNA对调控PDAC的作用机制以及其它肿瘤的治疗具有重要意义。在本研究中,我们探讨了miR-128在PDAC中的作用和机制。研究目的:本论文通过体内外实验,研究miR-128调节胰腺癌免疫的作用和细胞及分子机制。miR-128通过ZEB1/CD47轴调控包括DCs、CD8~+T细胞、NKT细胞在内的抗肿瘤免疫细胞在免疫微环境中的浸润,并通过ZEB1抑制EMT过程,最终抑制肿瘤的生长和转移。为进一步认识肿瘤免疫逃逸和肿瘤免疫治疗提供了一种新思路。研究方法:1.通过生物信息学方法,分析胰腺癌组织与正常胰腺组织中CD47、ZEB1的表达变化,应用miRanda、DIANA-micro T以及TargetScan数据库分析并预测可能靶向CD47的miRNAs。2.通过CCK8、划痕、迁移流式细胞术和荧光素酶报告基因等体外实验研究miR-128调控胰腺癌细胞生长、迁移和侵袭的作用。3.流式细胞术检测巨噬细胞的吞噬能力、肿瘤免疫微环境中免疫细胞的比例变化和树突状细胞的激活。4.通过构建miR-NC和miR-128稳定高表达的小鼠胰腺癌Panc02细胞系,应用C57BL/6小鼠构建胰腺癌原位移植瘤及皮下肿瘤模型。研究miR-128对Panc02细胞的生长、转移以及免疫微环境的影响。5.通过Western bloting和qRT-PCR等实验方法,研究miR-128与调控胰腺癌中CD47、ZEB1的作用机制和EMT进展。研究结果:1.生物信息学分析显示miR-128是靶向CD47和ZEB1的miRNA。CD47、ZEB1与胰腺癌患者的生存预后呈负相关且CD47与ZEB1的表达呈正相关;miR-128的低表达与PDAC的整体生存不良相关。2.体外实验表明,miR-128可以抑制Panc02细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭,增强巨噬细胞的吞噬能力和DCs的激活。3.体内实验,研究发现miR-128可以抑制PDAC的生长和转移。免疫微环境分析显示,肿瘤细胞过表达miR-128可增加肿瘤和脾脏中树突状细胞(DCs)、CD8~+T淋巴细胞和自然杀伤T细胞(NKT)的比例,从而增强抗肿瘤免疫。4.Western bloting和qRT-PCR证实miR-128可以调控胰腺癌细胞的ZEB1,进而抑制CD47,抑制EMT的进展并增加E-cadherin的表达,同时下调N-cadherin和Vimentin的表达。miR-128通过靶向ZEB1发挥抑癌作用,可以被ZEB1调控,进而影响CD47和EMT。研究结论:1.生物信息学分析得知,miR-128的表达与胰腺癌患者的生存率呈显著负相关,ZEB1和CD47在胰腺癌中高表达与患者的预后不良有关且ZEB1与CD47的表达是正相关。2.miR-128在Panc02细胞中的恢复减弱了细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制了EMT的进展并增加了E-cadherin的表达,同时下调了N-cadherin和Vimentin的表达。3.miR-128通过靶向ZEB1发挥抑癌作用,可以被ZEB1调控,进而影响CD47和EMT。4.过表达miR-128在体内实验中可明显抑制PDAC的肿瘤生长和转移,miR-128通过ZEB1/CD47轴调控包括DCs、CD8~+T细胞、NKT细胞在内的抗肿瘤免疫细胞在免疫微环境中的浸润,同时通过ZEB1抑制EMT过程,最终抑制肿瘤的生长和转移。5.我们与巨噬细胞或DCs共培养miR-NC或miR-128稳定过表达的Panc02细胞,发现miR-128过表达的Panc02细胞增强了巨噬细胞的吞噬作用和DCs的激活。6.miR-128可以通过在PDAC中ZEB1/CD47轴和EMT作为肿瘤免疫的重要调控因子。这些结果为基于CD47调控和EMT抑制剂的创新的临床前联合免疫治疗提供了理论基础。