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褪黑素对体外培养的脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响目的：第一部分：为了探讨褪黑素(MEL)在血管新生方面的作用和可能的抗肿瘤血管新生机制，以体外培养的脐静脉内皮细胞(HUVECs)为模型，观察MEL对HUVECs增殖和凋亡的影响。第二部分：在第一部分基础上，探讨高浓度MEL抑制HUVECs增殖和促其凋亡的可能细胞信号传导通路。方法：第一部分：原代培养HUVECs，免疫磁珠筛选后，并用免疫组化和电镜鉴定内皮细胞；MTT法测定不同浓度的MEL对HUVECs增殖的影响，并用流式细胞仪测定HUVECs细胞周期和细胞凋亡情况；免疫荧光、Western Blot和RT-PCR检测MEL对HUVECs内凋亡相关蛋白P53、Bcl-2和Bax及其基因表达情况。第二部分：在第一部分基础上，RT-PCR检测HUVECs褪黑素膜受体和核受体(MELR和RZR／ROR)的表达情况，以及MEL对其表达影响；检测高浓度MEL对影响HUVECs增殖和凋亡的重要的细胞内信号通路RTK／ERK／P13K／AKT／PKC／NF-κB蛋白表达影响；应用MELR受体阻滞剂Luzindole、ERK1／2激活抑制剂U0126、PI3K／AKT抑制剂LY294002以及PKC激活剂PMA和抑制剂GF 109203X，观察其对高浓度MEL抑制HUVECs增殖和相关细胞信号传递通路的影响。结果：第一部分：(1)成功的分离培养原代HUVECs，免疫磁珠筛选后能继续贴壁生长并传代，倒置显微镜下HUVECs呈鹅卵石状，Ⅷ因子内皮细胞细胞免疫化学着棕色，电镜下可见内皮细胞特征性的Weibel-Palade小体。(2)极低浓度MEL(lnmol／L)对HUVECs增殖无明显影响，但高浓度MEL(10nmol／L-1mmol／L)明显抑制HUVECs增殖，并有浓度依赖倾向，1mmol／L抑制作用最明显。(3)流式细胞仪显示高浓度MEL能明显阻滞HUVECs细胞周期，能阻止细胞进入S期，引起“S期停滞”；凋亡分析显示高浓度的MEL能明显促使HUVECs凋亡，1mmol／L时最明显。(4)高浓度MEL(100nmol／L和lmmol／L)明显调节凋亡相关基因P53、Bax和Bcl-2的表达。(5)Western Blot和免疫荧光检测高浓度MEL促进HUVECs凋亡与细胞内P53和Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白下调有关。第二部分：(1)正常HUVECs中褪黑素膜受体MELlaR和MELlbR都有明显表达，而核受体家族中有RORa和RORb表达，以RORb表达更为突出，RORC几乎无表达。(2) MEL受体参与MEL抑制HUVECs增殖机制，膜受体阻滞剂Luzindole只能部分阻断高浓度MEL的增殖抑制效应。(3)外源性MEL可使HUVECs上MEL受体表达下调，此过程可能与PKCα表达上调有关。(4) ERK1／2、PI3K／AKT和PKC信号通路与HUVECs增殖密切相关，其特异的通路抑制剂能明显抑制HUVECs增殖。(5)高浓度MEL通过抑制ERK1／2、PI3K／AKT和PKC信号通路抑制了HUVECs增殖和促其凋亡，相应的通路抑制剂或激活剂能分别部分促进或阻断MEL抑制HUVECs增殖效应。(6) MEL抑制HUVECs中NF-κB的表达并抑制其和DNA结合，从而抑制HUVECs增殖和促其凋亡。(7)特异的ERK1／2、PI3K／AKT和PKC信号通路抑制剂能不同程度的阻断HUVECs中NF-κB的活性，和MEL作用类似，说明MEL可通过抑制ERK1／2、PI3K／AKT和PKC信号通路抑制NF-κB的活性，从而影响细胞增殖和凋亡。结论：(1)高浓度的MEL能明显抑制HUVECs增殖和促其凋亡；(2)高浓度的MEL抑制HUVECs的增殖和促其凋亡与P53和Bax／Bc1-2基因和蛋白的表达改变密切相关；(3)高浓度MEL抑制HUVECs的增殖和促其凋亡可能与MEL受体、PI3K／AKT／ERK／PKC／NF-κB等多条信号途径密切相关。