论文部分内容阅读
遗传密码子扩充技术是利用正交性氨酰tRNA合成酶/tRNA（aaRS/tRNA）识别mRNA上的无义密码子（终止密码子或移码突变），实现在特定位点处插入非天然氨基酸。这些非天然氨基酸通常都具有特殊的物理、化学或生物特性，因此实现非天然氨基酸插入的遗传密码子扩充技术已在多个研究领域中展现出丰富多样的应用潜质。 柯萨奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）属于小RNA病毒科的一员，在人群中分布广泛，被认为是病毒性心肌炎最为重要的诱发因子之一，除此之外还与无菌性脑膜炎、胰腺炎以及I型糖尿病等疾病相关。尽管CVB3对人类健康具有一定的威胁，但是至今仍无可以临床使用的疫苗或药物。 对于CVB3的防治困境，结合遗传密码子扩充技术，本课题设想为CVB3的翻译包装设置一道遗传屏障。即在CVB3基因组内引入琥珀密码子UAG，在自然环境下，CVB3的翻译会因为引入的琥珀突变而提前终止，不能包装出完整病毒；在人工环境下，遗传密码子扩充能够正确识别引入的琥珀突变，并在相应位点处插入氨基酸，使CVB3的翻译可以继续下去，包装出完整病毒。本课题中所构建的CVB3突变体具有可控性，在人工环境中包装出的CVB3具有免疫原性，但不能在自然环境中进行病毒扩增，从而为CVB3的疫苗研制提供一个新的思路。 本课题选用甲烷八叠球菌来源的PylRS/tRNACUA。PylRS在真核细胞中不存在，所选用的Boc-lysine是人工化学合成的不存在于天然环境中，只能通过人工添加，从而进一步提升了CVB3的可控性以及安全性。 主要研究内容及结果如下： 1.根据文献调研，选取构建Methanosarcina mazei来源的 MmBocRS和U6-PyltRNACUA。经文献查阅以及Gene Bank比对确定最终片段序列进行全基因合成。将MmBocRS基因片段连入载体pcDNA3.1，再反向依次连入4个串联的PyltRNACUA片段。经酶切验证，遗传密码子扩充系统质粒构建成功，依次命名为MmBocRS-pcDNA3.1、MmBocRS-tRNA、MmBocRS-2tRNA、MmBocRS-3tRNA和MmBocRS-4tRNA。 2.将上述构建质粒瞬时转染入HEK293T细胞内，利用WesternBlot验证MmBocRS能在细胞中正常表达。通过实时定量PCR验证PyltRNACUA也能在细胞中正常表达，并且PyltRNACUA的表达量确是随拷贝数的增加而增加。结果表明构建的遗传密码子扩充系统质粒能在细胞中正常表达。 3.在pEGFP-N1上EGFP开放阅读框的39位进行琥珀突变，构建EGFP琥珀突变体质粒pEGFP-N1-UAG。pEGFP-N1-UAG与遗传密码子扩充系统质粒共转染细胞，显微镜下观察荧光及Western Blot结果均表明遗传密码子扩充系统质粒在HEK293T细胞内能正常发挥功能，提示通过非天然氨基酸Boc-lysine能够实现控制蛋白表达。又进一步利用流式细胞术分析非天然氨基酸的插入效率，pEGFP-N1-UAG的绿色荧光蛋白并没有如预期随着PyltRNACUA拷贝数的增加而增加，最高大概为43.10％左右，与野生型EGFP的表达率66.10%相比，本课题中所构建的遗传密码子扩充系统可以使Boc-lysine的相对插入效率达到65.20%（相对值=43.10%/66.10%）。 4.利用反向遗传学技术在CVB3基因组的不同位置分别进行了琥珀突变，共构建了16个CVB3琥珀突变体，经酶切以及测序表明CVB3琥珀突变体构建成功。CVB3琥珀突变体质粒与MmBocRS-4tRNA质粒共转染细胞，对转染产物进行反复冻融，收获病毒液，感染下一代细胞，分别对两代所表达出来的CVB3进行检测。针对CVB3的5’-UTR设计引物，利用实时定量PCR分析表明Boc-lysine的添加与否确实可以使CVB3琥珀突变体的表达有明显差异，提示实现了通过非天然氨基酸控制病毒扩增。通过病毒RNA提取、逆转录、PCR以及扩增产物送测序发现突变体存在回复突变的现象。 5.为了保证每次试验的时空一致性，并且避免每次转染受细胞状态、细胞密度以及实验操作者经验影响等因素，利用慢病毒包装技术成功构建可以表达遗传密码子扩充系统的稳定细胞株BocRS-tRNACUA。对稳定细胞株进行了Western Blot以及实时定量PCR检测，还进一步转染pEGFP-N1-UAG验证其功能。结果表明稳定细胞株BocRS-tRNACUA中MmBocRS和PyltRNACUA可以稳定表达，转染结果可以观察到绿色荧光表明稳定细胞株确具有遗传密码子扩充功能。 综上所述，本课题针对CVB3尚无临床可用预防性疫苗的现状，构建了CVB3琥珀感染性克隆，并通过遗传密码子扩充及非天然氨基酸Boc-lysine实现了为CVB3设置一道遗传屏障，隔离人工环境与自然环境，使改造的病毒基因组在人工条件下能正常翻译，在自然条件下不能自我复制，即利用遗传密码子扩充技术获得了具有可控性的CVB3突变体。而所构建的突变体虽然在自然条件下不能自我复制但并不会失去病毒原有的免疫原性，为CVB3及其他小RNA病毒疫苗的研制提供了一个新的思路。