I.虎杖查尔酮合酶基因克隆、定点突变与功能分析　　查尔酮合酶(Chalconesynthase，CHS)是研究得最为广泛的一类植物Ⅲ型聚酮合酶(typeⅢpolyketdesynthase，typeⅢPKS)。它能催化三分子来自丙二酰辅酶A的乙酰基团通过连续缩合反应连接到一分子的p-香豆酰辅酶A上，之后以克莱森型(Claisen-type)环化反应生成芳香族四酮化合物查尔酮。本论文以中药虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)为材料，从其中分离到一个Ⅲ型聚酮合酶基因，命名为PcCHS1，并对其进行了体外功能研究。系统进化分析与体外酶促功能研究均表明，PcCHS1是一个典型的查尔酮合酶。PcCHS1能在pH7-8时体外高效地催化合成查尔酮作为其单一产物，在pH9时，除合成查尔酮之外，还能合成一定量的苯亚甲基丙酮(benzalacetone，BA)。同源建模结果表明，PcCHS1与从紫花苜蓿(Medicagosativa)中分离到并已解析晶体结构的MsCHS具有非常相似的三维结构和催化腔体。　　在对PcCHS1进行一系列定点突变研究后表明，一些位于非活性位点甚至处在蛋白表面的氨基酸残基并不仅仅有维持蛋白结构的作用，这些氨基酸残基还能直接参与对酶活性的调控。例如，当PcCHS1第82位的谷氨酰胺突变为脯氨酸后，Q82P突变蛋白的查尔酮合成活性相对野生型有所降低，且在pH9时不能合成BA；当第198位的半胱氨酸突变为苯丙氨酸后，C198F突变蛋白几乎完全失去活性；但是，Q82P/C198F双突变酶蛋白却能在pH8-9时回复较高的BA合成活性，而且在pH9时，该双突变蛋白还能较大量地催化合成许多CHSs常见的两种脱轨产物CTAL和BNY；此外，当PcCHS1第105位的精氨酸突变为谷氨酰胺之后，R105Q改变了野生型蛋白BA合成活性对pH值的依赖性。上述结果表明，远离活性中心甚至是处在酶蛋白表面的氨基酸残基也可能对Ⅲ型PKS的结构与催化活性产生直接的影响。此外，本论文还对PcCHS1其他的一些靠近活性中心的氨基酸残基进行了定点突变来研究其对PcCHS1催化活性的影响，并取得了一定的结果。　　II.青蒿肉桂醇脱氢酶基因的功能研究　　肉桂醇脱氢酶(cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD)最常见的功能是在体内或体外以NADPH或NADH为辅因子将一些羟基肉桂醛如：松柏醛、5-羟基松柏醛、芥子醛及香豆醛等还原为其相应的醇。后者在体内作为木质素的四种醇单体参与木质素生物合成。本论文对本实验之前从中药青蒿(ArtemisiaannuaL.)分泌腺毛cDNA文库中分离到的一个肉桂醇脱氢酶基因(AaCAD)进行了表达模式分析及其编码蛋白的体外酶促功能研究。此外还探讨了AaCAD除参与木质素生物合成之外，其在青蒿素生物合成过程中可能扮演的角色。本论文具体的研究结果如下：　　系统进化分析暗示AaCAD与拟南芥中分离到的AtCAD4和AtCAD5亲缘关系十分接近，而后二者已被证实在拟南芥中参与木质素的生物合成。通过半定量RT-PCR分析表明AaCAD在青蒿的叶和根中表达最多，其次是在花和腺毛之中，而在茎中的表达量最低。对AaCAD进行体外酶促功能验证后的结果显示重组AaCAD蛋白在体外能够可逆地氧化还原许多CAD蛋白常见的底物，例如松柏醛、芥子醛、香叶醛、肉桂醛及其对应的醇。意外的是，在接近生理pH条件下，该重组蛋白还能在体外将青蒿素生物合成的前体青蒿醛还原为青蒿醇。　　根据以上结果，并结合AaCAD是从青蒿素生物合成场所--分泌腺毛的表达文库中分离而来这一事实，我们可以推测：AaCAD可能在木质素和青蒿素的生物合成过程中均起到了一定的作用。