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第一部分:催产素对健康雄性大鼠胃运动的影响及其机制研究目的:催产素（oxytocin,OT）是由下丘脑视上核和室旁核合成并储存于神经垂体的激素。已有资料表明OT能影响胃肠道的活动,由于动物种属差异、检测部位不同等原因,不同研究组报道的有关OT影响胃肠道活动的结果并不一致,OT影响胃肠道运动的受体后机制也不清楚。Monstein等报道在人类胃肠道有催产素受体（oxytocin receptor,OTR）mRNA表达,但表达于何种细胞并不清楚。本研究旨在弄清OT对胃收缩活动的影响,定位消化道上OTR并探讨OT引起胃收缩的受体后机制。方法:胃内压记录2%戊巴比妥钠（56 mg/kg）麻醉大鼠,依次行气管插管、颈静脉插管和股动脉插管。将一塑料气囊从食管插入胃腔后固定。气囊内注入生理盐水使胃内基础压力维持在30 mmHg左右。大鼠胃收缩活动稳定1小时后开始实验。观察阻断剂效应时,注射阻断剂10分钟后再注射OT。胃离体肌条张力记录快速牺牲大鼠,取出胃放置于4℃krebs液中。沿胃小弯剪开胃腔,在胃各部位沿纤维走向剪4条肌条（4 mm×10 mm）,分别为:胃体环行肌、胃体纵行肌、胃窦环行肌和幽门管环行肌。小心去除粘膜。将肌条分别放置在含有5ml krebs液（37℃）的浴槽中孵育,并每隔15分钟更换浴槽中krebs液。待肌条自发收缩稳定后开始实验。平滑肌细胞长度测量牺牲大鼠后取出胃体,去除粘膜和浆膜。将肌条剪成2 mm×2 mm小块并转移到8 ml含有0.1%Ⅱ型胶原酶和0.01%胰酶抑制剂的31℃hepes—ringer液中消化,共消化两次,每次45分钟。消化完后用无酶hepes—ringer液冲洗3次后将组织置于5 ml新鲜hepes—ringer液中振荡30分钟,用500μm的细胞筛过滤收集单个平滑肌细胞。倒置显微镜下观察细胞形态并测量细胞长度。每个培养皿只观察一个细胞。Western blot将胃体肌条匀浆后12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electropHeresis,SDS-PAGE）电泳,用湿转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜（nitrocellulose blotting membranes,NC）上。5%脱脂奶粉室温下封闭1小时,TTBS（tris buffer saline with tween-20）冲洗3次后将NC膜和一抗（1:400）共孵育,4℃过夜。TTBS冲洗三次后室温下将膜与HRP标记二抗（1:20000）共孵育一小时。洗去二抗,ECL显影。免疫组织化学技术新鲜胃标本冰冻切片,厚10μm。3%H2O2—甲醇溶液去掉内源性过氧化物酶活性,5%兔血清封闭。加入山羊抗OTR多克隆抗体（1:100）4℃过夜。磷酸盐缓冲液（pHospHate buffer solution,PBS）冲洗三次后滴加生物素标记兔抗羊IgG工作液室温孵育30分钟,冲洗后再滴加辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）标记链酶卵白素工作液室温孵育30分钟,PBS冲洗3次。3,3-二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）镜下显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。统计分析在整体实验中,以胃位相性收缩峰值的平均值为观察指标。注射OT前3分钟峰值的平均值为基础值,注射OT后不同时间段峰值的平均值为效应值,效应值与基础值的差值作为统计指标。在离体肌条实验中,以肌条平均张力为观察指标,加入OT前3分钟的平均张力为基础值,加入OT后不同时间段的平均张力为效应值,效应值与基础值的比值为统计指标R。所有数据均采用均数±标准误表示,采用单因素方差分析和t检验进行统计学处理,以P＜0.05为显著性差异界值。结果:1.静脉注射OT（1.5μg/kg）后,大鼠胃自发收缩活动表现为先抑制后兴奋的双向反应。注射OT后第一分钟,胃收缩幅度下降3.04±0.94 mmHg,注射OT后第13分钟和第15分钟,收缩幅度分别增加4.16±2.76 mmHg和4.84±3.00 mmHg。其中OT引起的早期抑制效应被胆囊收缩素A（cholecystokinin,CCK1）受体阻断剂devazepide完全逆转,但devazepide不影响OT引起的胃收缩兴奋效应。2.OT(10-9 M-10-6 M)引起离体胃体环行肌、胃体纵行肌、胃窦环行肌和幽门管环行肌肌条的收缩增强,各肌条收缩张力在加入OT后1—3分钟内达到最高。OT(10-9M-10-6M)引起的肌条收缩兴奋效应呈明显的浓度依赖性。加入四种不同浓度的OT(10-9 M—10-6 M)后第三分钟,胃体环行肌的R值分别增加到1.18±0.09、2.13±0.32（P＜0.05 vs.vehicle control）、3.92±0.55（P＜0.05 vs.vehicle control）和5.04±0.61（P＜0.05 vs.vehicle control）:胃体纵行肌的R值分别增加到1.04±0.02、1.13±0.08、1.39±0.14（P＜0.05 vs.vehicle control）和2.20±0.22（P＜0.05 vs.vehicle control）。加入三种不同浓度的OT(10-8 M-10-6 M)后第一分钟,幽门管环行肌的R值分别增加到1.33±0.10（P＜0.05 vs.vehicle control）、1.48±0.17（P＜0.05vs.vehicle control）和1.53±0.16（P＜0.05 vs.vehicle control）;胃窦环行肌的R值分别增加到1.03±0.02（P＜0.05 vs.vehicle control）、1.31±0.13（P＜0.05vs.vehicle control）和1.52±0.26（P＜0.05 vs.vehicle control）。3.OTR阻断剂atosiban(10-6 M)抑制胃体环行肌肌条的自发收缩。Atosiban预处理10分钟后,OT(10-8 M和10-7 M)引起的胃体环行肌兴奋效应减弱。而电压依赖性Na+通道阻断剂河豚毒素(tetrodotoxin,TTX 10-5 M)和毒蕈碱型（muscrinic,M）乙酰胆碱受体阻断剂atropine(10-6 M)则不影响OT引起的胃体环行肌兴奋效应。4.OT(10-8 M-10-6 M)引起急性分离的平滑肌细胞收缩,细胞长度变短。加入三种不同浓度的OT后细胞长度分别缩短4.5%±1.0%、9.3%±4.7%（P＜0.05vs.control）和17.0%±3.73%（P＜0.05 vs.control）。Atosiban(10-6 M)和三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-tripHospHate,IP3）受体阻断剂2-氨基乙基二苯硼酸盐（2-aminoethoxydipHenylborane,2—APB）(10-5 M)均能抑制OT(10-6 M)引起的平滑肌细胞收缩。5.Western blot检测到大鼠胃和子宫有OTR的表达。免疫组织化学染色发现OTR表达于胃体平滑肌细胞,且环行肌和纵行肌均有表达。肌间神经丛和粘膜未见表达。结论:OT对胃运动具有紧张性兴奋作用;外源性OT引起胃自发收缩活动先抑制后兴奋,其中抑制效应是通过CCK释放引起的,而兴奋效应是通过作用于胃平滑肌细胞上的OTR引起的,并由IP3介导。第二部分:血管升压素对健康雄性大鼠胃平滑肌肌条收缩活动的影响及其机制研究目的:血管升压素（vasopressin,VP）也是神经垂体激素。尽管OT和VP在结构上具有80%的同源性,且高浓度时都能与对方的受体结合,但两种激素却有各自的生理学功能。VP的生理作用主要是促进肾集合管对水的重吸收,当机体大失血时,VP浓度急剧升高,引起血管收缩。有资料表明VP也能影响胃肠道的活动,Monstein等报道在人类胃肠道有血管升压素受体（vasopressin receptor,VPR）mRNA的表达,但何种细胞表达该受体并不清楚。本研究旨在探讨VP对胃收缩活动的影响是否与OT有所不同,并定位消化道上VP受体。方法:胃离体肌条张力记录同第一部分。免疫组织化学技术新鲜胃体标本冰冻切片,厚10μm。3%H2O2—甲醇溶液去掉内源性过氧化物酶活性,5%兔血清封闭。滴加山羊抗V1a受体多克隆抗体（1:100）4℃过夜。然后滴加兔抗山羊IgG抗体—HRP多聚体孵育30分钟,PBS冲洗3次。DAB镜下显色。V1a受体和NeuN免疫荧光双标4%多聚甲醛固定胃标本,石蜡切片厚4μm。常规脱蜡,水化。枸橼酸盐抗原修复,5%兔血清封闭。同时滴加山羊抗V1a受体多克隆抗体（1:100）和小鼠抗神经元细胞核（neuronal nuclei,NeuN）单克隆抗体（1:100）4℃过夜。然后同时滴加四甲基异氰酸罗达明（TRITC）标记兔抗山羊IgG（1:50）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记兔抗小鼠IgG（1:50）,室温避光孵育1小时,PBS冲洗,甘油缓冲液封片后荧光显微镜下观察并拍照。结果:1.VP引起胃体环行肌肌条的收缩增强,且收缩张力在加入VP后第3分钟达到最高点。VP(10-10M-10-6M)引起胃体环行肌的兴奋效应呈明显的浓度依赖性。10-10 M VP不引起肌条收缩的明显变化。VP浓度达到10-7M,兴奋效应达到最强。加入不同浓度的VP(10-10M-10-6M)后,第3分钟的R值分别从1增加到1.11±0.04、3.47±0.57（P＜0.05 vs.control）、4.60±0.95（P＜0.05 vs.control）、6.60±1.29（P＜0.05 vs.control）和5.434±1.11（P＜0.05 vs.control）。2.V1受体拮抗剂V-1880(10-7 M)抑制胃体环行肌的自发收缩。加入V-1880后,R值从1下降到0.86±0.01（P＜0.05 vs.control）。3.TTX(10-6 M)预处理完全阻断各浓度VP(10-9 M-10-6 M)引起的胃体环行肌肌条收缩的兴奋效应。V—1880(10-7 M)和atropine(10-6 M)预处理能部分阻断VP(10-9 M-10-8 M)引起的兴奋效应,而N受体阻断剂六烃季铵(hexamethomnium,10-5M)不影响VP引起的肌条收缩兴奋效应。4.冰冻切片免疫组化染色发现V1a受体表达于胃体肌间神经丛。5.石蜡切片免疫荧光同时标记V1a受体和NeuN,结果进一步证实V1a受体表达于肌间神经丛上的神经元。结论:VP与OT兴奋胃运动的机制不同。外源性VP通过与肌间神经元上的V1a受体结合,促进运动神经元释放乙酰胆碱而引起胃运动增强。