论文部分内容阅读
石斑鱼是中国南方沿海各省、香港和台湾地区以及东南亚各国的重要海水养殖鱼类，经济价值极高。但近年来石斑鱼病害频繁发生严重制约了石斑鱼养殖业的健康可持续发展。虹彩病毒是石斑鱼病毒性疾病主要的流行性病原之一，石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)是近年来发现的一种鱼类高致病性病毒，其致死率高达90％以上。为揭示病毒感染致病的分子机制，本论文渐聚焦于病毒免疫逃逸机制及病毒对宿主免疫基因的调控作用这一核心科学问题，研究SGIV编码的一个肿瘤坏死因子受体(Tumour Necrosis Factor Receptor,TNFR)类似物SGIV VP51在病毒感染复制过程中的作用机制;同时研究分析石斑鱼模式识别受体(MDA5和LGP2)和干扰素刺激基因TRIMs对病毒感染复制的免疫调节作用。取得的主要创新研究结果如下: 1.SGIV ORF051L(SGIV VP51)编码TNFR类似物。 SGIV ORF051L全长696bp，编码一个含231个氨基酸。SGIVVP51含有三个半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich domains，CRDs)和一个跨膜结构域(transmembrane domain)。亚细胞定位结果显示SGIVVP51主要定位于细胞质，且CRD1、CRD2和跨膜结构域的缺失对VP51亚细胞定位有较大影响。与对照组相比，SGIV VP51的胖头鲤上皮细胞(Fathead Minnow,FHM)的不仅生长速度显著加快，且细胞周期也发生改变，即VP51过表达加速细胞由G1期进入S期，从而促进了细胞分裂进程，CRD1缺失对该功能有较大的影响。此外，过表达VP51显著抑制病毒诱导的细胞凋亡及caspase-3活性，并最终促进病毒复制;并且，过表达VP51显著降低病毒凋亡诱导基因LITAF的表达。 2.SGIV VPS1是病毒感染增殖的重要毒力因子，并调节宿主的免疫炎症反应。 应用同源重组技术成功构建VP51缺失重组病毒(△51-SGIV)。缺失VP51后SGIV诱导细胞凋亡的能力增强。进一步运用△51-SGIV进行体内体外感染实验，发现VP51缺失后SGIV病毒的毒力显著减弱，提示VP51是病毒感染复制的重要毒力因子。荧光定量PCR对△51-SGIV感染宿主细胞和鱼体后的宿主因子进行检测，结果揭示VP51缺失调节了病毒感染细胞或鱼体后宿主干扰素相关免疫因子或炎症因子的表达。由此推测VP51作为SGIV感染的一个重要毒力因子，可能通过调节宿主细胞凋亡和免疫炎症反应，从而影响病毒的感染与复制。 3.石斑鱼模式识别受体MDA5和LGP2通过不同的方式参与SGIV病毒的感染。 克隆鉴定斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)编码的MDA5和LGP2同源物，分别命名为EcMDA5和EcLGP2。荧光显微镜观察结果显示EcMDA5和EcLGP2均分布于细胞质基质中，SGIV感染后其定位特征发生明显改变，而RGNNV感染对定位没有影响。EcMDA5体外过表达上调宿主细胞促炎症因子和干扰素相关因子的表达，从而抑制病毒感染的进程和病毒复制。而EcLGP2抑制宿主细胞干扰素相关分子的表达，并促进RNA病毒的感染和复制。上述结果说明EcMDA5和EcLGP2在鱼类病毒感染过程中发挥着不同作用。 4.石斑鱼干扰素刺激基因TRIMs通过正调或负调干扰素免疫反应影响病毒复制。 克隆和鉴定赤点石斑鱼编码的三个TRIM家族基因，分别是EcTRIM8、EcTRIM32和EcTRIM16L。亚细胞定位结果显示EcTRIM8和EcTRIM32均点状聚集分布于细胞质中，而EcTRIM16L则均匀分布于细胞质中。三个TRIM基因调节病毒复制的作用机制也存在差异，EcTRIM8和EcTRIM32通过促进宿主细胞干扰素相关分子和部分促炎症因子的表达，抑制RGNNV和SGIV的感染和复制。而EcTRIM16L抑制宿主细胞干扰素相关分子，促进SGIV的感染和复制。上述结果表明不同的干扰素刺激基因在宿主抗病毒免疫反应中发挥着不同的作用机制。 总之，鉴定病毒SGIV编码的一个TNFR类似物VP51是病毒的一个重要毒力因子，并阐明该基因能够通过调节细胞凋亡和宿主干扰素及炎症免疫反应来影响病毒复制。同时克隆石斑鱼的模式识别受体和干扰素刺激基因，并阐明它们在鱼类病毒感染中的不同作用机制。上述研究结果从病毒免疫逃逸及宿主免疫防御两个角度在一定程度上阐明了SGIV感染致病的分子机制，不仅为石斑鱼虹彩病毒的弱毒疫苗开发奠定了一定理论基础，也为寻找抗病毒药物分子靶标提供重要信息。