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角鲨烯广泛存在于动物、植物以及微生物中,对于生物体具有抗氧化和防辐射、参与胆固醇代谢、提高机体对氧的利用率以及对多种脂溶性毒素的解毒作用等重要的生理功能。由于角鲨烯的抗癌、抗衰老、防辐射等特性,它已经被广泛应用于各个领域之中。目前所应用的角鲨烯主要来自鲨鱼肝油的提取,而由于在其它动植物中含量都很低,因此并无实际的利用价值,因而通过微生物发酵来生产角鲨烯有望成为取代传统鲨鱼肝油提取的有效手段。在大多数原核生物中,藿烷类化合物是细胞膜的重要组成部分,是以异戊烯基为单位合成并产生的五环三萜类物质,而角鲨烯则是该代谢途径中的一个中间代谢产物。由于角鲨烯形成后会直接参与到下一步环化反应而不能在生物体内大量积累,因而要利用原核微生物发酵生产角鲨烯就必须对其进行基因改造。
芽孢杆菌在自然界各个角落都广泛分布,它是目前种类最多、研究和应用最广泛的细菌之一。在芽孢杆菌中普遍存在yisP基因,该基因被认为具有合成角鲨烯的功能,因此芽孢杆菌极有可能成为生产角鲨烯的工程菌株的原材料。yisP下游环化酶基因sqhC是将链状角鲨烯合成环状萜类化合物的关键酶基因,因而通过构建sqhC的缺失突变体,则能够阻断角鲨烯进一步环化形成萜类物质的过程,由此积累中间产物角鲨烯。
在本实验中,我们选择了一株植物内生芽孢杆菌SWB16并首先对其进行了鉴定,接着我们又根据鉴定结果设计特异的引物来克隆其yisP基因。为了构建产角鲨烯工程菌株,我们克隆了SWB16的yisP下游环化酶基因sqhC并利用同源重组法构建了该基因的缺失突变体,从而为其后续发酵并应用于产角鲨烯工程菌株的研究奠定了良好的基础。
试验结果如下:
1.通过形态、生理生化特征分析,SWB16被初步鉴定为芽孢杆菌。由于16SrDNA的聚类分析结果不能将SWB16与其它枯草芽孢杆菌近缘种区分开来,因而根据gyrA的系统发育分析,菌株SWB16与解淀粉芽孢杆菌聚为一支,从而将该菌株初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
2.SWB16的yisP基因的克隆,说明解淀粉芽孢杆菌SWB16中存在角鲨烯参与的代谢途径,同时我们发现yisP基因具有较高的变异率,yisP系统进化树的聚类情况与gyrA相符,yisP基因除了能够区分不同种的芽孢杆菌,也能够用来区分枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的亚种。通过将yisP和gyrA基因联合分析,菌株SWB16被最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens subsp.plantarum。
3.比较gyrA和yisP基因序列发现:yisP基因在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的种内保守,但在种间的yisP基因序列相似性均明显低于gyrA,说明yisP基因变异率比gyrA更高。因此yisP可以作为一个新的系统进化指标,并与gyrA基因联合分析来鉴定枯草芽孢杆菌的近缘种。
4.构建了SWB16的sqhC基因缺失突变体,结果显示:构建的打靶载体与SWB16染色体基因组之间发生了同源重组,用SWB16sqhC基因的特异性引物扩增的sqhC基因片段长度由野生型的1461bp变为重组后的2800bp左右。测序结果表明,在SWB16菌株的sqhC基因上、下游之间确实插入了新霉素抗性基因neo,表明sqhC基因被敲除,其缺失突变菌株构建成功。