论文部分内容阅读
目的:观察局部亚低温对大鼠全脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion)血脑屏障(blood brain barrier , BBB)损伤有保护作用,进一步探索亚低温保护血脑屏障的机制。方法:1实验分组及动物模型的制备取48只雄性SD大鼠,体重200-250g(河北医科大学试验动物中心提供),月龄2～3个月。随机分为3组,假手术组(S组)、缺血/再灌注组(R组)、亚低温组(H组),每组16只。S组:暴露股动静脉,只分离双侧颈总动脉,经枕骨大孔腹侧开颅暴露基底动脉第二无血管区,穿线但不阻断。R组:采用3血管阻断法阻断双侧颈总动脉、基底动脉10 min后再开放。H组:采用3血管阻断法阻断双侧颈总动脉,基底动脉10 min后开放,再灌注前即刻经股静脉输注10℃3.5ml生理盐水,同时冰袋冷敷头部,用60 W白炽灯距离大鼠约37cm高度直接照射身体,通过调节灯至身体的距离及头部冰块的数量和面积使鼓膜温度在1 min内降至32～34℃,直肠温度同时降低,20 min内恢复并维持在36.5～37.5℃。低温持续时间为3h,3h后仍用白炽灯照射身体缓慢复温。除低温组外,其余各组于相应时间点腹腔内注射等量的室温生理盐水。脑缺血前5min(T1)、脑缺血10min(T2)、再灌注后10min(T3)采集股动脉血监测动脉血氧分压和二氧化碳分压。2标本的采集及检测方法2.1大鼠脑组织内MMP-9的浓度的测定48只雄性SD大鼠于再灌注12h,每组随机抽取8只首先水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠,完整取出脑组织,右侧大脑除去额叶皮质其余脑组织制成匀浆,以3500r/min转速离心10min,取上清液液氮罐内保存备用。按照大鼠脑组织匀浆MMP-9酶联免疫试剂盒说明书要求测定各浓度标准品的吸光度,绘制标准曲线,求得回归方程。根据回归方程最后求得每个标本的MMP-9浓度。2.2大鼠脑组织含水量的测定完整取出脑组织后,去除中脑、脑桥、垂体等留取左侧大脑组织,用滤纸吸干表面水分后置于干燥小瓶中,-20℃冰箱保存备用。用干湿重法(110℃,24h烘干)计算脑组织含水量作为脑水肿程度的判断。计算方法:脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。2.3大鼠每克脑组织内伊文思蓝含量的测定每组其余8只雄性SD大鼠于再灌注12h用10%水合氯醛再次麻醉大鼠,经股静脉注入2% EB生理盐水溶液(4 m1/ kg) 1h后开胸,通过左心室灌注室温生理盐水(灌注压为110 mmHg),直到右心房流出的液体无色为止断头取脑。去除小脑及脑垂体留取双侧大脑组织剥离干净软脑膜、血凝块,称重,匀浆,放入其4倍体积甲酰胺的离心管中,加上橡皮塞50℃水浴48h,以3000r/min转速离心15min,取上清液待测。2.4光镜观察皮质的病理学改变取右侧大脑额叶同一部位,切取3mm×3mm的组织块,冷盐水冲洗后置于4%多聚甲醛中浸泡过夜,在10×40倍光镜下观察皮质的病理学改变。同一位置按照“快、小、轻、准”原则在冰盘上切取1mm×1mm×1mm的组织块于4%戊二醛中固定,4℃冰箱中保存1h以上,送电镜室在透射电镜下观察BBB的超微结构的改变。结果:1各组间体重、月龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。2在股动脉置管后脑缺血5 min(T1)、脑缺血10 min(T2)、再灌注后15 min(T3)血气指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。3大鼠脑组织内MMP-9浓度的测定S组脑组织内MMP-9浓度为(3.87±0.66)%,R组为(7.20±2.83)%,H组为(5.14±1.77)%。与S组相比,R组脑组织内MMP-9浓度明显增高(P<0.05);与R组相比,H组脑组织内MMP-9浓度明显降低(P>0.05)。4大鼠脑组织含水量的测定S组脑组织含水量为(77.11±1.44)%,R组为(80.34±1.88)%,H组为(77.35±1.64)%。与S组相比,R组脑组织含水量明显增高(P<0.05);与R组相比,H组脑组织含水量明显降低(P>0.05)。5大鼠每克脑组织内伊文思蓝含量的测定S组脑组织内伊文思蓝含量为(3.51±0.17)ug/g,R组为(4.11±0.35)ug/g,H组为(3.83±0.15)ug/g。与S组相比,R组每克脑组织内伊文思蓝含量明显增高(P<0.05);与R组相比,H组每克脑组织内伊文思蓝含量明显降低(P>0.05)。6光镜下皮质的病理学改变S组:神经元形态结构正常,胞浆丰富、均匀、淡染,核圆形或椭圆形,核仁明显。R组:损伤范围严重,神经细胞严重固缩、深染,尼氏体消失,核浆融合,细胞周围中度水肿。H组:大部分神经元细胞轻度皱缩,结构基本正常,核椭圆形,核仁清楚,细胞周围轻度水肿。7透射电镜下BBB的超微结构改变: S组:毛细血管外周小部分轻度水肿,腔面微绒毛数量减少,管腔内未见血细胞。线粒体部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒,吞饮小泡数量稍微减少。R组:毛细血管周围高度水肿(四面),腔内一个红细胞,微绒毛数量稍微减少。线粒体大部分嵴或部分膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,吞饮小泡数量减少。H组:毛细血管腔内有一个红细胞(血红蛋白),微绒毛数量减少,血管周围小部分水肿,小于一面线粒体部分或大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象吞饮小泡和微绒毛数量减少。通过结果说明:S组损伤最轻,R组损伤最重,H组介于二者之间,但明显比R组损伤减轻。结论:局部亚低温具有保护由全脑缺血/再灌注造成BBB的损伤,减轻脑水肿的作用,其机制可能与MMP-9有关。