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目的:构建去泛素化酶库并且筛选寻找调控TNF诱导细胞坏死信号通路的去泛素化酶。初步研究去泛素化酶对TNF诱导的细胞坏死作用,进一步阐明去泛素化酶对细胞坏死作用的机制。研究内容:在去泛素化酶库里对筛选出的调控TNF诱导细胞坏死信号通路的去泛素酶USP13的酶活性以及两个结构域对执行细胞坏死功能是否具有重要作用进行初步研究。方法:1.通过查找去泛素化酶库所包含的基因,设计这些基因特异的克隆引物,用高保真的DNA聚合酶扩增相应的基因,并将上述的片段连接到pbob-c-flag慢病毒载体中。2.将上述质粒按照慢病毒实验的包装方法,获得可以表达相应基因的慢病毒,病毒感染L929细胞,感染48小时后用TNF刺激感染有相应基因的细胞株,利用流式细胞仪分析细胞死亡的情况。通过数据分析,筛选出对TNF诱导细胞坏死有作用的去泛素化酶USP13。3.设计USP13酶活突变体以及结构域缺失体的基因特异的克隆引物,用高保真的DNA聚合酶扩增相应的片段,并将上述的片段连接到pbob-c-HA载体中,将这些质粒按慢病毒包装的方法包装慢病毒并感染L929细胞中,48h后加入TNF刺激,利用流式细胞仪分析TNF刺激下细胞死亡的情况。结果:1.根据已知去泛素化酶库基因序列,构建71个去泛素化酶基因。2.在L929中过表达去泛素化酶,利用流式细胞仪分析,筛选出USP13对TNF诱导的细胞坏死具有促进作用。3.构建USP13基因酶活突变体和相关结构域缺失体,利用流式细胞仪分析发现USP13-C345A突变同样能促进TNF诱导的细胞坏死,USP13的zf-UBP和UBA结构域不能促进对TNF诱导的细胞坏死。结论:1.过表达USP13可以促进TNF介导的细胞坏死信号通路。2.USP13调控细胞坏死的功能是不依赖于其去泛素化酶的活性的。3.USP13的zf-UBP和UBA结构域对于酶执行细胞坏死功能都很重要。