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干旱和土壤盐渍化现已成为制约我国农牧业发展的两大主要非生物胁迫。霸王（Zygophyllum xanthoxylum）作为一种典型的荒漠植物,在长期进化过程中形成了其自身特有的抗旱与耐盐机制:即它能够从含盐量较低的土壤中吸收大量的Na+并上运至地上部,将其作为一种有益且廉价的渗透调节物质储存于叶片的液泡中,以此来帮助自身抵御渗透胁迫。Na+由胞质区域化到液泡的过程主要受到液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX1）的调控,因此霸王ZxNHX1在其响应盐胁迫及渗透胁迫的过程中具有至关重要的作用。而在甜土植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中,已有报道证明定位于液泡膜上的不同AtNHXs对Na+和K+的选择性也有所不同。本课题组前期将ZxNHX1与AtNHX1分别转入Na+敏感型酵母AXT3K中,结果显示,盐处理下ZxNHX1转化子的长势明显优于AtNHX1转化子;此外,将上述基因分别转入液泡蛋白酶缺失酵母TY001中,分析Na+（K+）/H+离子交换活性发现,ZxNHX1区域化Na+的能力显著高于AtNHX1、而其区域化K+的能力则显著低于AtNHX1,以上结果表明ZxNHX1与AtNHX1在Na+、K+选择性上存在差异。由于蛋白质的结构决定其功能,我们推测导致这种差异的原因可能与NHXs的结构密切相关。鉴于此,本研究通过对ZxNHX1与AtNHX1氨基酸序列与蛋白质三维结构进行比对分析,筛选出3个可能影响二者离子选择性的关键位点并利用定点突变技术获得10个突变基因;而后将ZxNHX1、AtNHX1及这10个突变基因分别转入Na+敏感型酵母菌株AXT3K中,以验证各转基因酵母在生长与Na+、K+积累方面的差异;同时,将上述基因分别转入液泡蛋白酶缺失酵母菌株TY001中分析Na+/H+及K+/H+交换活性。取得如下主要结果:1.将ZxNHX1第265位氨基酸残基（T265）突变为AtNHX1在该位点所对应的氨基酸（F）后,在50 mM NaCl处理下,ZxNHX1 T265F转化子的生长较突变之前明显减弱,Na+含量显著下降16.4%,而K+含量则显著增加10.8%,同时其在各浓度盐处理下的Na+/H+交换活性均受到显著抑制,K+/H+交换活性则受到明显促进;而AtNHX1中该位点（F268）突变为ZxNHX1所对应的氨基酸（T）后,盐处理下AtNHX1 F268T转化子的生长、Na+和K+含量及Na+/H+、K+/H+交换活性较突变之前均未发生明显变化。基于以上结果,推测ZxNHX1第265位氨基酸残基是影响其离子选择性的关键位点,而AtNHX1的第268位氨基酸与其Na+、K+选择性无关。2.当ZxNHX1第341位氨基酸残基突变为AtNHX1所对应的氨基酸（ZxNHX1 V341I）后,盐处理下ZxNHX1 V341I转化子的生长、Na+和K+含量、Na+/H+和K+/H+交换活性不会受到影响,表明ZxNHX1第341位氨基酸残基不是决定其Na+、K+选择性的关键位点;而将AtNHX1中该位点突变为ZxNHX1的相应氨基酸（AtNHX1 I344V）后,在50 mM NaCl处理下,AtNHX1 I344V转化子的Na+含量较突变之前显著上升8.2%,K+含量显著下降18.8%,且各浓度盐处理下其Na+/H+交换活性较突变之前均显著增加,而K+/H+交换活性则显著下降。根据以上结果推测该位点可能是影响AtNHX1的Na+、K+选择性的关键位点之一。3.ZxNHX1第419位氨基酸残基突变为AtNHX1所对应的氨基酸（ZxNHX1S419T）后能够显著抑制其在50 mM NaCl下的生长,且其Na+积累较突变前显著降低21.2%,Na+/H+交换活性明显减弱,而K+的积累则显著增加21.0%且K+/H+交换活性明显增加,推测ZxNHX1第419个氨基酸可能是影响其离子选择性的关键位点之一;而AtNHX1中该位点突变为ZxNHX1的相应氨基酸（AtNHX1T422S）后,其在50 mM NaCl下的生长较突变之前显著下降7.8%,Na+的积累下降10.0%,且Na+/H+交换活性受到显著抑制,而K+含量与K+/H+交换活性则较突变之前均未发生明显变化。基于以上结果,推测该位点在AtNHX1中可能只是影响其Na+选择性的关键位点。4.ZxNHX1第265和419位的两个氨基酸残基同时突变为AtNHX1相对应的氨基酸（ZxNHX1 T265F&S419T）后,50 mM NaCl下其生长较突变前显著下降12.1%,Na+含量显著降低29.4%,K+含量显著增加34.5%,且各浓度盐处理下双突菌株的Na+/H+交换活性均受到显著抑制,而K+/H+交换活性则显著增加;同时,与单突对ZxNHX1的Na+、K+转运能力的影响相比,双突的抑制作用更强。以上结果进一步表明ZxNHX1第265和419位氨基酸残基对其离子选择性具有重要影响,且二者的作用存在叠加效应。以上结果揭示了ZxNHX1与AtNHX1的Na+、K+选择性存在差异的重要原因,为进一步研究霸王响应盐胁迫的机制提供了理论依据。