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目的:本研究的目的是通过腹膜下联合注射D-氨基半乳糖(D-Gal)和脂多糖(LPS)建立小鼠急性肝损伤模型,并经高压尾静脉注射法将带有标签的外源性基因GFP-LC3转染至小鼠肝脏,通过荧光显微镜观察、透射电镜观察、WB分析以检测小鼠急性肝损伤模型中肝细胞内自噬(autophagy)的发生情况;通过免疫荧光法检测其肝细胞凋亡情况;通过比较ASPP2+/+野生型小鼠和ASPP2+/-基因缺失型小鼠在饥饿状态下肝细胞的自噬及凋亡情况,了解自噬与凋亡的相关性。为我们能够更好地认识急性肝损伤的发病过程奠定基础,为日后进一步研究这一疾病的发生机制提供线索。
方法:1.将50只SPF级雌性Balb/C小鼠随机分为对照组、饥饿组和急性肝损伤组,其中急性肝损伤组又分为急性攻击后8小时、12小时、24小时组,每组10只。所有小鼠经高压尾静脉注射法注射GFP-LC3质粒100μg(溶于2ml无菌生理盐水中),尾静脉注射24小时后处死动物,取其血液、肝脏及心、脾、肺、肾等组织。饥饿组小鼠于尾静脉注射后禁食24小时,自由饮水;急性肝损伤组小鼠分别于处死前8小时、12小时、24小时,经腹膜下联合注射D-Gal(350mg/kg)和(LPS100μg/kg),体积共100μl。常规生化法检测血清ALT(alanine aminotransferase,谷氨酸氨基转移酶)、AST(aspartate aminotransferase,天门冬氨酸氨基转移酶)水平;普通光学显微镜下观察HE染色的肝组织病理改变;透射电镜下观察肝细胞超微结构变化及自噬体;荧光显微镜下观察各组织GFP-LC3的表达情况及其在各组小鼠肝组织中的表达差异;提取肝组织总蛋白,通过WB(WesternBlotting,蛋白质印迹法)检测分析肝组织中自噬相关蛋白LC3(Microtubule-associated protein lightchain 3,微管相关蛋白轻链-3)的更新;应用免疫荧光技术检测肝损伤各组小鼠肝组织中M30(存在于早期凋亡细胞中的CK18上的一个caspase断裂位点)的表达差异。
2.将12只体重为18-22g的雌性Balb/C小鼠分为四组,每组3只。A组小鼠为ASPP2+/-基因缺失型小鼠,B、C、D组小鼠基因型为ASPP2+/+野生型。A、B组小鼠经高压尾静脉注射法注射GFP-LC3质粒100μg(溶于2ml无菌生理盐水中);C组小鼠经高压尾静脉注射混合溶于2ml无菌生理盐水的GFP-LC3质粒100μg和重组ASPP2腺病毒(rAd-ASPP2)100μl;D组小鼠经高压尾静脉注射GFP-LC3质粒100μg和重组△ASPP2腺病毒(rAd-△ASPP2)100μl。所有小鼠禁食24小时,自由饮水。于尾静脉注射24小时后处死动物,取其血液及肝脏。荧光显微镜下观察比较各组小鼠肝细胞中GFP-LC3荧光点的表达差异;免疫荧光法检测各组小鼠肝组织中M30的表达差异。
结果:急性肝损伤组小鼠12小时后相继出现呼吸微弱、不能站立等情况。血清ALT、AST水平显著高于对照组和饥饿组。肉眼可见小鼠肝脏表面有炎性渗出物、质软易碎;光镜下可见到大片肝细胞坏死、炎性细胞浸润;电镜下可见线粒体肿胀,大量肝细胞崩解、坏死,还可见到凋亡的肝细胞。各组在电镜下均可见到双层膜的自噬体,其内容物有胞质及细胞器。在荧光显微镜下观察,可见经高压尾静脉注射转染的质粒在肝组织中大量表达,在脾中少见,在心、肺、肾组织中几乎无表达;另外,发现饥饿组及急性肝损伤12小时组、24小时组GFP-LC3自噬荧光点明显多于其他组。蛋白质印迹结果显示饥饿组、急性肝损伤12小时组、24小时组自噬相关蛋白LC3转化率高于其他组。通过免疫荧光染色发现急性肝损伤8小时组小鼠肝脏M30表达水平显著高于其他组,急性肝损伤12小时组表达水平降低,但仍高于24小时组。ASPP2+/一组小鼠肝细胞中,GFP-LC3自噬荧光点显著多于其他三组,而M30阳性细胞少见;ASPP2+/+,rAd-ASPP2组小鼠肝细胞中,荧光点数目显著低于其他组,而M30阳性细胞多于其他组;ASPP2+/+组和ASPP2+/+,rAd-△ASPP2组间比较,GFP-LC3自噬荧光点数目及M30阳性细胞数目均无明显差异。
结论:
1.成功地用D-Gal和LPS建立了小鼠急性肝损伤模型。
2.成功地经高压尾静脉注射法将外源性基因GFP-LC3转染至小鼠肝脏,并且表达良好。通过GFP-LC3自噬荧光点检测到了小鼠急性肝损伤模型中肝脏的自噬体形成量。
3.发现在D-Gal和LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型中,腹腔注射药物12小时后小鼠肝细胞自噬水平明显增加。
4.D-Gal和LPS诱导的小鼠急性肝损伤模型中,在所观察的时间点,各组小鼠肝细胞自噬水平与凋亡水平有呈负相关的趋势;在ASPP2表达水平不同的小鼠中,随ASPP2表达量增加,小鼠肝细胞凋亡水平增加、自噬水平降低。