原发性免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia, ITP）是临床最为常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。ITP临床表现为皮肤粘膜出血、月经过多、内脏出血、甚至颅内出血,严重影响人类健康。其发病机制主要为机体自身免疫耐受失衡,产生了针对血小板糖蛋白（glycoprotein, GP）的自身抗体,大部分为主要针对GPⅡb/Ⅲa和/或GPIb/Ⅸ的IgG,该抗体与血小板膜自身GP抗原结合,导致血小板被单核巨噬细胞系统吞噬破坏。免疫反应异常的机制包括抗原递呈细胞、T细胞和B细胞之间复杂的相互作用。如Thl/Th2细胞亚群失衡,血小板特异性自身反应性T细胞和B细胞的活化,调节性T细胞数量的减少或抑制功能受损,以及细胞毒性T细胞对血小板的破坏。但是,对血小板自身抗原免疫耐受的破坏及自身抗体产生的机制尚不明确。研究证实,在健康成年个体内,发现具有潜在自身反应活性的T细胞,这些自身反应性T细胞可通过诱导调亡及免疫无能等多种机制来维持自身免疫耐受状态。而在这一过程中,免疫调节酶吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase,IDO）及具有免疫调节功能的树突状细胞（dendritic cells,DCs）起了非常重要的作用。IDO是肝脏外唯一可催化色氨酸（Try）分子中吲哚环氧化裂解,从而沿犬尿酸（Kyn）途径分解代谢的限速酶。IDO特异性地表达在巨噬细胞和DCs上。IDO可通过降解局部组织中的色氨酸,影响淋巴细胞的功能。近年来研究发现,在许多自身免疫性疾病中存在着IDO介导的色氨酸分解代谢作用的异常,如多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、弥漫性毒性甲状腺肿、以及类风湿性关节炎等。DCs是目前已知体内最重要的抗原递呈细胞,而且也是唯一能激活初始型T细胞的抗原递呈细胞,在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年的研究表明,DCs不仅参与对外来抗原的免疫反应,而且参与了对自身抗原的免疫耐受。最近研究证明,DCs的免疫调节功能与其表达功能性IDO密切相关。研究发现调节性DCs表达高水平的功能性IDO。在自身免疫性疾病中,表达高水平功能性IDO的DCs能够诱导自身反应性淋巴细胞凋亡和活化调节性T细胞,这是维持外周免疫耐受的重要机制。调节性DCs的免疫调节功能除了与IDO在细胞内的表达水平有关外,还与IDO的酶活性密切相关。IDO的表达可由免疫炎性介质如IFNγ、IFNα（?）TNF等所诱导。B7-1/B7-2分子与CTLA-4/CD28的结合是启动树突状细胞IDO酶活性的必要条件,当这种结合断开时,IDO处于无活性状态。另有研究发现,可溶性CTLA-4可诱导人成熟DCs表达具有酶活性的IDO,重组人CTLA-4-Ig Fc融合蛋白,与共刺激分子B7-1、B7-2具有高度亲和力,亦可诱导功能性IDO在树突状细胞的表达,使T细胞微环境色氨酸缺乏,犬尿氨酸积累,从而抑制T细胞的增殖和促进淋巴细胞的凋亡。除此之外,经CTLA-4-Ig诱导的表达酶活性IDO的树突状细胞还可以促进调节性T细胞（regulatory T-cells,Tregs）的生成,进而抑制效应性T细胞活性,诱导免疫耐受。在我们以前的研究中也发现,CTLA-4-Ig在体外能够以细胞依赖性方式诱导ITP患者自身反应性T细胞产生特异性免疫耐受。以上研究内容为我们应用CTLA-4-Ig诱导DCs治疗免疫性血小板减少症提供了重要依据。目的：检测ITP患者体内IDO表达,并利用CTLA-4-Ig体外诱导ITP患者外周血树突细胞表达具有酶活性的IDO,检测IDO表达及活性变化。通过检测IDO+DCs对T细胞增殖、活化、凋亡以及调节性T细胞的影响,研究IDO+DC的致免疫耐受作用。方法：◆选择ITP患者15例,包括5位初诊ITP患者和10位复发ITP患者。正常对照来自于12例健康志愿者。分离外周血中单个核细胞和血小板。◆将单个核细胞加入细胞因子培养7天,培养后的未成熟DCs用不同的细胞因子培养2天。将培养后的成熟DCs分为2组：组1为加入CTLA-4-Ig（10μg/ml）培养者；组2为未加入CTLA-4-Ig （0μg/ml）培养者。◆实时定量聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）检测IDO mRNA的表达,流式细胞术PBMCs和成熟DCs中IDO的表达率,蛋白印迹法（Western boltting）检测IDO的表达。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）检测ITP患者和正常对照色氨酸（Trp）及其特异代谢产物犬尿氨酸（Kyn）的浓度。将诱导后的两组DCs分别与患者血小板特异性T淋巴细胞组成混合淋巴细胞反应（MLR）体系,检测体系中T淋巴细胞增殖率,流式细胞术检测T淋巴细胞增殖、活化、凋亡情况及Treg细胞的比例。结果：◆ITP患者DCs中的IDO表达与正常对照组相比,IDO的平均荧光强度（MFI）在ITP患者DCs中显著减少（376.9±28.00vs124±23.10；P<0.01）CTLA-4-Ig对ITP患者DCs中IDO的表达和活性的影响组1（培养液中加入CTLA-4-Ig,浓度10μg/ml）与组2（培养液中不加CTLA-4-Ig,即0μg/ml）。组1中IDO mRNA的相对表达量是组2的36.8倍（p=0.0004）。Western Blotting和流式细胞分析也证实了组1的DCs中IDO的表达量比组2的要明显的高（401.0±44.9vs124.0±23.1；P<0.0001）。HPLC法测定了DCs培养上清液中犬尿氨酸的浓度,组1中的犬尿氨酸显著高于组2（0.86±0.08uM vs0.39±0.03uM；P=0.0179）。而加入IDO特异性抑制剂1-MT后,其上清液中的犬尿氨酸浓度明显降低（0.86±0.08uM vs0.19±0.05uM；P=0.0108）。CTLA-4-Ig诱导DCs功能性IDO高表达的致免疫耐受作用a) IDO+DCs对T细胞增殖的抑制作用：经CTLA-4-Ig诱导后的IDO+DCs比未经CTLA-4-Ig诱导的DCs明显抑制了血小板特异性T细胞的增殖（0.43±0.10vs0.65±0.06；P<0.0001）；然而,当加入1-MT阻断IDO活性后,CTLA-4-Ig诱导后的IDO+DCs对血小板特异性T细胞增殖的抑制作用明显降低（0.74±0.04vs0.43±0.10；P<0.0001）b) IDO+DCs对T细胞活化的抑制作用：流式细胞术检测了T细胞表面活化标志CD25,CD69和CD71在T细胞上的表达,发现组1中CD3+/CD25+细胞、CD3+/CD69+和CD3+/CD71+细胞的比例为22.7%±4.1%,8.0%±6.5%和24.4%±10.4%,在组2中的比例分别为31.0%±4.7%,15.0%±11.0%,32.0%±12.5%。c) IDO+DCs对淋巴细胞凋亡的促进作用：流式细胞术检测到与组2相比,组1中的淋巴细胞凋亡明显增加。组1中CD4+细胞、CD8+细胞和CD19+细胞上的AnnexinV%分别为21.8%±7.8%,10.7%±3.1%和18.9%±9.9%,组2分别为13.8%±6.1%,7.8±2.9%,13.3%±9.3%,明显高于组2。d) IDO+DCs可诱导调节性T细胞（Treg）的生成：检测CD4+CD25+Foxp3+（Treg）细胞的比例得出组1中Treg细胞的比例明显高于组2（5.8%±1.7%vs2.7%±0.9%；P=0.0001）。结论：◆ITP患者DCs中的IDO表达降低。CTLA-4-Ig增强ITP患者DCs中功能性IDO的表达。CTLA-4-Ig诱导树突细胞IDO高表达致免疫耐受：IDO+DCs抑制T细胞增殖；抑制T细胞活化；促进淋巴细胞凋亡的促进；诱导调节性T细胞（Treg）的生成。意义：ITP患者IDO的表达及酶活性均存在异常,IDO介导的色氨酸分解代谢受损是ITP重要发病机制之一。CTLA-4-Ig可以提高ITP患者DCs功能性IDO的表达,抑制T细胞的增殖与活化,促进淋巴细胞凋亡,提高Treg细胞比例,且以上作用为IDO依赖性。IDO介导的色氨酸分解代谢可能在ITP发病中起重要作用,并为ITP的治疗提供了新途径。原发性免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia, ITP）是由于机体免疫失耐受,产生的抗血小板自身抗体与血小板表面特异性抗原结合,导致血小板在网状内皮系统过度破坏引起血小板减少。此外,多种细胞免疫机制异常,如Thl极化、调节性T细胞数目降低或者抑制功能缺陷、细胞毒性T细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）介导的血小板破坏等在ITP的发病中发挥重要作用。到目前为止,出现上述异常的原因尚未明确。目前有关ITP的实验研究多为临床试验和药物治疗等方面,没有理想的动物模型,导致许多体外试验总结的结论不能在体内试验得到证实。本实验用大鼠血小板免疫CBA近交系小鼠,通过输入抗原诱导模型鼠产生免疫反应,发现CBA小鼠外周血中血小板的数量出现缓慢降低,说明该模型能够较好的模拟ITP患者体内血小板持续性降低的情况,可为研究ITP的发病过程提供工具。近年来,Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）在介导先天性免疫和获得性免疫反应中的作用日益受到人们的重视。TLRs是由一组结构相似的受体组成的蛋白家族,目前共发现13种TLRs家族成员,其中TLR1～11表达于人类,主要分布在包括树突状细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞的表面。TLRs是免疫细胞的激活剂,是先天免疫系统的关键介体,并调节适应性免疫系统的活性。有证据表明,TLRs在免疫和炎症性疾病中发挥了作用,其中细胞内表达的TLR7参于了APC的活化和自身抗体的产生。有研究发现TLR7与特异性配体结合后可促进B细胞活化、增殖和病理性抗体的产生,且ITP患者中的TLR7水平升高了,但具体传导途径尚在摸索之中。有研究认为,内源性共刺激分子参与B细胞调节这一过程,其中B细胞激活因子（B cell activating factor, BAFF）是新近发现的一种细胞共刺激分子。BAFF主要由单个核细胞如树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞表达。BAFF共有三种受体：穿膜蛋白活化物（transmembrane activation and calcium-modulatorand cyclophilin ligand interactor, TACI）、B细胞成熟抗原（B cell maturation antigen,BCMA）和B细胞激活因子受体（B cell activating factor-receptor, BAFF-R）,这三种受体在B细胞表面均有表达。BAFF与受体结合后,通过招募TRAF可激活NF-κB等信号途径,调节下游相关基因的表达,从而促进B细胞增殖、活化和自身抗体产生。由此可见,BAFF在调节自身免疫性疾病的过程中发挥重要作用。但ITP患者中BAFF的作用机制尚未阐明。综上,TLRs与BAFF均参与了B细胞活化和抗体产生的过程,是自身免疫性疾病的发病机制之一。国内外学者对TLRs和BAFF之间是否存在相互作用展开了研究。有学者通过体内实验证实,活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）通过激活TLRs信号途径增强小鼠脾脏中BAFF的mRNA和蛋白质表达。鉴于ITP与TLR7、TLR7与BAFF、BAFF与B细胞、B细胞与ITP的散在文献报道,提示TLR7/BAFF/BAFF受体信号通路可能在ITP的发病中发挥重要作用。在本研究中,我们探讨了这样一种假设：APC中的TLR7,影响自身BAFF分泌,并通过与BAFF受体的结合作用于B细胞,进而影响自身抗体的产生。本研究结果将TLR7与疾病活动度相关联,阐述了TLR7/BAFF/BAFF受体信号通路在ITP发病机制中的作用。目的建立ITP动物模型,并对模型鼠体内血小板计数及表面相关抗体进行检测。使用建立的ITP小鼠模型及对照组小鼠,检测它们脾脏单个核细胞TLR7、BAFF、BAFF受体和血清BAFF的表达；通过TLR7激动剂（imiquimod）和TLR7沉默慢病毒研究TLR7对小鼠血小板计数的影响、对PAIgG水平的影响、对BAFF水平的影响和对BAFF受体的影响。探讨TLR7/BAFF/BAFF受体信号通路在ITP发病机制中的作用。方法：◆用正常Wistar大鼠的血小板免疫CBA小鼠,通过输入抗原诱导模型鼠产生免疫反应。然后通过血液分析仪检测CBA小鼠外周血中血小板的数量,通过流式细胞术检测体内血小板表面相关抗体。◆采用可表达GFP的针对鼠TLR7（NM₁33211）的慢病毒沉默载体,并通过荧光显微镜观察GFP表达情况,评估转染效率,并收集RAW264.7细胞,然后通过实时PCR检测细胞中TLR7的mRNA水平,Western blotting测定细胞中TLR7的蛋白水平。◆将首次免疫三周后,血小板计数最低时的小鼠作为“ITP小鼠”。ITP小鼠和对照组小鼠分别再分成四组。组1：ITP小鼠给予大鼠血小板注射（n=10）,对照组小鼠给予生理盐水（n=8）；组2：ITP小鼠给予大鼠血小板注射（n=8）,对照组小鼠生理盐水（n=8）,并分别在小鼠尾部静脉注射107TU（transduction unit,TU）阴性对照载体；组3：ITP小鼠给予大鼠血小板注射（n=8）,对照组小鼠生理盐水（n=8）,并分别在小鼠尾部静脉注射107TU慢病毒沉默载体；组4：ITP小鼠给予大鼠血小板注射（n=8）,对照组小鼠生理盐水（n=8）,并分别隔日给予25gg咪喹莫特（TLR7激动剂）。◆实时定量PCR（realtime quantitative PCR）检测小鼠TLR7mRNA表达；Western blotting检测蛋白浓度；酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunoadsorbent assay, ELISA）检测血清和细胞上清BAFF水平；通过流式细胞术分析平均荧光强度（median fluorescence intensity, MFI）,检测PAIgG、BAFF受体表达。结果：◆模型小鼠的血小板计数和血小板表面抗体的检测与对照组相比,模型组小鼠外周血中血小板从免疫后第1周开始逐渐降低（P<0.05）,在免疫后第3周降至最低（P<0.01）,随后血小板数量开始慢慢回升。将免疫后第3周小鼠体内血小板数值降至最低时的模型组小鼠作为ITP小鼠进行后续研究。流式检测结果显示,ITP小鼠PAIgG的平均荧光值为84.15±24.47,而对照组小鼠为41.19±18.14。与对照组相比,ITP小鼠PAIgG的水平显著增高（P<0.01）。◆小鼠体内TLR7、BAFF、BAFF受体的表达a小鼠脾脏单个核细胞中TLR7的表达：与对照组相比, ITP小鼠中TLR7mRNA表达增加了3.14倍（P=0.003）；ITP小鼠TLR7的蛋白水平也显著增加（p=0.033）。b小鼠脾脏单个核细胞和血清中BAFF的表达：ITP小鼠中SMCs上清液中的BAFF的水平与对照组相比,明显增加（ITP小鼠：766.09±43.03pg/ml,对照组：519.19±43.95pg/ml,P=0.004）。试验小鼠组和对照组的血清BAFF水平在免疫前分别为7015.27±454.33pg/ml和7043.45±435.89pg/ml。两组间并无明显差异（P=1）。首次免疫接种三周后,ITP小鼠中的血清BAFF水平相较于免疫前明显升高（12448.34±695.23pg/ml vs7015.27±454.33pg/ml,P=0.000）。在ITP小鼠（12448.34±695.23pg/ml）和对照组（7920.0±375.15pg/ml）间也存在明显差异（P=0.000）。用生理盐水注射前和3周后,对照组中没有发现显著性差异（P=0.224）。首次免疫接种四周后,相比对照组,ITP小鼠内血清BAFF水平明显增加（ITP小鼠：8481.66±211.54pg/ml,对照组小鼠：7463.67±198.55pg/ml, P=0.006）。c小鼠脾脏单个核细胞中BAFF受体的表达：ITP小鼠中BAFF的三种受体中,与对照组相比,只有BAFF-R是明显升高的（P=0.006）,并没有发现BCMA和TACI水平的明显变化。◆沉默慢病毒的转染效率的检测荧光显微镜观察证实转染三天后超过90%的RAW264.7细胞被转染,并收集RAW264.7细胞,检测细胞中TLR7mRNA水平显著下降,相对于对照组仅3.82±0.62%（p=0.000）；细胞中TLR7的蛋白检测显示,TLR7沉默慢病毒可以有效地干扰RAW264.7细胞中TLR7的蛋白表达（p=0.048）。◆TLR7对血小板计数的影响TLR7沉默慢病毒明显增加了相对血小板计数（1.11±0.12vs0.84±0.09,P=0.025）,而咪喹莫特则明显降低了ITP小鼠中的相对血小板计数（0.59±0.05vs0.84±0.09,P=0.034）。但各对照组中没有发现明显的变化。◆TLR7对PAIgG水平的影响首次免疫接种四周后,与对照组相比PAIgG水平在ITP小鼠中显着增加（27.44±3.68vs3.00±0.43,P=0.002）。咪喹莫特则明显增加了PAIgG的水平（56.63±13.20,P<0.001）,而TLR7沉默慢病毒在ITP小鼠中明显降低了PAIgG水平（9.99±2.78,P=0.026）。在四个对照组中没有发现PAIgG水平的明显差异。◆TLR7对BAFF水平的影响咪喹莫特明显升高了ITP小鼠中SMCs上清液中的BAFF水平（1145.17±123.70pg/ml vs766.09±43.03pg/ml,P<0.001）,但对照组中并没观察到此类变化；而TLR7沉默慢病毒并没有明显改变ITP小鼠组和对照组中BAFF的水平。咪喹莫特明显升高了ITP小鼠内血清BAFF的水平（10578.43±417.54pg/ml,P=0.001）,而TLR7沉默慢病毒降低了ITP小鼠内血清BAFF的水平（7258.36±359.17pg/ml,P=0.011）；四个对照组的结果无明显差异。◆TLR7对BAFF受体的影响流式细胞术结果表明,对ITP小鼠或对照组小鼠中TLR7激发或抑制后,BAFF-R水平没有发现明显的差异。结论：◆试验建立的ITP小鼠模型不仅能够模拟ITP发病过程中血小板减少的情况,而且模型鼠体内PAIgG的水平明显升高。◆ITP小鼠中TLR7水平是升高的；BAFF水平升高；BAFF的三种受体中仅有BAFF-R的表达是升高的。◆ITP小鼠中TLR7的活化可能负调节ITP小鼠的血小板数值,和疾病活动度相关。◆ITP小鼠中TLR7对于PAIgG起到了促进作用。◆ITP小鼠中TLR7增进了BAFF的分泌。◆ITP小鼠中ITP小鼠中TLR7和BAFF-R间没有直接的互相作用。意义：◆试验建立的ITP小鼠模型,能够模拟ITP发病过程中血小板降低的病理过程,为深入研究ITP的发病机理提供了良好的动物模型。TLR7/BAFF/BAFF-R信号传导途径可能在ITP的发病中发挥作用。阻断TLR7/BAFF/BAFF-R信号传导通路将为治疗ITP提供新方法。