目的:暴发性肝衰竭(Fulminant Hepatic Failure, FHF)是由于多种原因所引起的肝细胞大量坏死而出现的以肝功能严重受损为特征的综合征。具有起病急、预后差及病死率高的特点,迄今仍无有效治疗,国外报导病死率在40-70%[1],国内经过连续攻关报导仍为50%左右[2],降低病死率是临床工作中迫切需要解决的难题。虽然近年来在暴发性肝功能衰竭的发病机制、临床诊断、治疗等方面取得了较大进展,但其发病机制仍不甚明确,若能进一步明确其发病机制必将提高FHF的防治水平。目前国内外对于暴发性肝衰竭发病机制的研究强调内毒素引起的触发作用。最近的研究证明内毒素等的毒性作用主要是间接性的,它依赖于许多炎症介质的释放,特别强调细胞因子的作用,其中TNF-α起着关键作用[3]。临床和基础研究都明确观察到在暴发性肝炎所致肝功能衰竭患者血清TNF-α升高,并初步阐明了TNF-α在其发病机制中的作用[4]。研究认为内毒素进入肝脏激活单核/巨噬细胞系统,引起TNF-α为中心的多种炎症介质的释放,介导炎症反应的瀑布效应造成肝细胞坏死。NF-κB是一个多级转录因子,它调控一系列基因的表达,如编码炎性细胞因子、趋化因子、干扰素、MHC蛋白、生长因子、细胞粘附因子的基因和病毒基因,与机体免疫、炎症等病理生理过程密切相关[5]。调控合成与炎症反应有关的蛋白质的细胞因子主要有:前炎性细胞因子:TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF;趋化因子:IL-8、巨噬细胞炎性蛋白-1、巨噬细胞趋化蛋白-1;炎性反应酶类;粘附分子:细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、E-选择素;受体:IL-2受体、T细胞受体(β链)。它们大多参与机体的炎症反应;可促进炎症细胞积累、活化或炎症介质的释放,加重炎症反应。LPS和TNF-α都是NF-κB的强烈激活剂[6]。NF-κB是介导过度炎症反应的核心环节。国内外对于NF-κB的研究多集中于肿瘤和缺血再灌注方面,而对其在暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及机制研究较少。本研究基于上述理论,旨在用免疫组织化学方法检测NF-κB在FHF病理损害过程中表达的变化,以期证实NF-κB在暴发性肝衰竭中的作用,进一步阐明暴发性肝衰竭的发病机制。方法:1.研究对象:雄性清洁级Wistar大鼠45只,体重180-200g。将大鼠随机分为模型组30只,对照组15只。模型组腹腔注射D-氨基半乳糖800mg/kg,之后立即皮内注射脂多糖10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。对照组腹腔注射同样体积的生理盐水。2.标本的采集和保存:分别于注药后2,4,8,12,24小时行股静脉放血处死,各时间点取模型组6只,对照组3只大鼠。留取血清,放血处死后立即剖腹取肝脏,取适量肝组织经10%中性甲醛溶液固定,余经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。3.肝组织标本采用常规HE染色:光镜下观察肝组织病理学改变,观察炎症、坏死的形成与发展。4.肝组织标本的免疫组织化学染色:采用常规免疫组化S-P法,对肝组织标本进行NF-κB、iNOS和TNF-α的免疫组化染色。NF-κBp65和TNF-α结果评估参照Fromowitz[7]的综合计分法进行。iNOS结果判定参照Shimizu[8]等判定标准采用半定量方法,分别按染色细胞的分布和染色深度记分,最终结果用阴性、弱阳性、阳性、强阳性来表示。5.应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析,所有计数资料均采用等级表示,各指标不同时间点间统计分析用Wilcoxon秩和检验及秩相关分析。两指标间的相关性用秩相关进行分析。P<0.01时有显著性差异。结果:1.各组动物一般状况观察:对照组大鼠一般状况较好,无死亡。模型组随着给药后时间的延长,大鼠一般状况逐渐恶化,依次出现饮水减少、毛发竖立、精神萎靡、反应迟钝、嗜睡,11小时死亡1只大鼠。2.各组肝组织形态学大体观察:(1)肝脏大体标本观察:对照组不同时间点,肝组织形态学差异不大,大鼠肝脏呈鲜红色,光泽好,质地柔软有弹性,边缘锐利。模型组肝脏组织随时间延长出现充血、出血点、局部淤血、坏死,肝组织脆性增加及大块坏死。(2)肝组织HE染色:对照组不同时间点,肝组织形态学差异不大,肝小叶结构完整,肝板排列整齐,无变性、坏死。模型组随着时间延长,肝组织发生的病理改变逐渐加重,肝组织的病理学光镜下可观察到肝细胞水肿、肝窦淤血、炎细胞浸润、肝组织出血、肝细胞大片坏死,肝小叶结构破坏。肝细胞损伤的方式主要为炎症坏死,也可见少量肝细胞具有细胞凋亡形态学改变。3.各组肝组织免疫组织化学改变:(1) NF-κBp65蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞(肝窦内皮细胞和枯否细胞)染色阳性,细胞浆有弱表达,极少见核阳性表达。模型组表达阳性细胞主要为肝细胞、枯否细胞。2h组主要是非实质细胞的胞浆着色。4h、8h、12h、24h组以肝细胞胞核着色为主。4h、8h、12h组核阳性表达的细胞数明显增多,且明显高于对照组。(2) iNOS蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞(枯否细胞、肝窦内皮细胞)染色阳性,模型组随着肝脏炎症程度加重阳性率增高,染色程度加深。(3) TNF-α蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞(枯否细胞)染色阳性,模型组随着肝脏炎症程度加重阳性率增高,染色程度加深。4. NF-ΚB与iNOS,TNF-α在实验性暴发性肝衰竭中的关系,研究结果显示模型组大鼠肝脏变性坏死炎症程度较重且随时间延长炎症坏死程度加重。NF-κB与iNOS之间呈正相关(r=0.801, P<0.01),NF-κB与TNF-α之间也呈正相关(r=0.852, P<0.01)。结论:1应用D-GalN+LPS造模可反映暴发性肝衰竭发生的病理变化过程,并可动态观察暴发性肝衰竭肝脏组织病变演变过程,适于暴发性肝衰竭发病机制的研究。2从蛋白水平观察了在暴发性肝衰竭发病过程中NF-κB从胞浆到胞核的激活过程。从而证实NF-κB被激活,参与了暴发性肝衰竭的病理损害过程,是暴发性肝衰竭的重要发病机制。3暴发性肝衰竭时,肝细胞中的NF-κB的高表达,提示在暴发性肝衰竭病理过程中,肝细胞不仅是致病因子攻击的靶细胞,而且还参与了暴发性肝衰竭的发病过程。4暴发性肝衰竭肝组织中NF-κB与iNOS,TNF-α密切相关,随着NF-κB的活化,iNOS和TNF-α表达增多。从而证实NF-κB在暴发性肝衰竭肝组织炎症坏死中起重要作用,提示NF-κB是暴发性肝衰竭发病过程中的关键环节,这为临床治疗暴发性肝衰竭提供了新的干扰靶点。