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研究背景淋巴管生成不仅参与了胚胎淋巴管发育、组织损伤修复、慢性炎症等生理和病理过程，而且在肿瘤淋巴道转移也具有十分重要的作用。大量临床病理研究证实：非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤、头颈部肿瘤和前列腺癌等实体肿瘤高表达VEGF-C和VEGF-D，并与淋巴管密度(lymphatic microvesse l density,LVD)、淋巴管侵袭(lymphatic vessel invasion, LVI)，以及淋巴结转移密切相关。肺腺癌极易发生区域性淋巴结和远处器官转移，难以手术切除，对放、化疗敏感性较低，预后很差，目前认为淋巴管生成可能是肺腺癌淋巴结转移的早期核心机制。近年研究证实，肿瘤诱导的淋巴管生成促进了癌细胞的转移性扩散，导致肿瘤患者预后差、生存率低。血管内皮生长因子(VEGF)-C、VEGF-D、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)等是目前公认的淋巴管生成因子，它们通过结合淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell , LEC)上的受体，继而促进LEC增殖、迁移和管状结构形成，从而诱导淋巴管生成。目前被广泛认可的LEC特异性标记物包括血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)、Prox-1、淋巴管内皮透明质酸受体-1 (LYVE-1)和Podoplanin等，LEC特异性标记物的发现促进了LEC生物学功能研究的发展。随着LEC的成功分离和多种用于研究淋巴管生成的动物模型的建立，淋巴管生成迅速成为肿瘤领域的研究热点。我们研究小组此前的研究也表明NSCLC能够通过表达VEGF-C诱导瘤周淋巴管生成；瘤周淋巴管生成对NSCLC的发生、发展起重要作用；瘤内的淋巴管呈塌陷状态，并不具有介导淋巴道转移的能力。临床资料显示，虽然肺腺癌极易发生淋巴道转移，但是临床患者淋巴结转移存在很大的差异性；很多情况下原发肿瘤的大小与肿瘤是否发生远处转移不平行。通过对肿瘤细胞在淋巴管生成中发挥诱导作用的复习，我们设想除VEGF-C、VEGF-D外是否存在其他的淋巴管生成促进因子？另一方面，是否存在直接抑制淋巴管生成的因子？本课题旨在筛选与肺腺癌淋巴管生成相关的基因，为控制肺腺癌淋巴管转移寻找新的作用靶点。目的利用全基因组芯片筛选技术，采用Human Genome U133 Plus 2.0 Array差异筛选肺腺癌淋巴管生成相关的基因。通过GenBank数据库生物信息学分析，结合已有文献报道，确定被选的基因，初步验证其在肿瘤淋巴管生成中的作用。方法1.免疫组织化学法检测淋巴管内皮标记物Podoplanin在34例肺腺癌组织和5例肺良性病变组织中的表达，计算LVD，按LVD评分对肺腺癌淋巴管高、低转移进行分组，分析LVD与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移等的关系。2.采用全基因组芯片筛选的方法，构建肺腺癌高淋巴管生成和低淋巴管生成差异表达的基因文库(cDNA library)，采用Human Genome U133 Plus 2.0 Array筛选肺腺癌淋巴管生成相关的基因，GenBank数据库生物信息学分析，结合文献报道选取上调和下调基因，采用real time PCR进一步验证差异表达情况。3.以NSCLC为研究对象，利用免疫组织化学方法检测NSCLC组织中上调基因（以IGFBP7为对象）、下调基因（以CDH1为对象）的表达情况，分析IGFBP7、CDH1表达与患者年龄、性别、肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移的关系。4. RT-PCR检测人肺癌细胞株和小鼠肺癌细胞株(lewis lung cancer, LLC）的IGFBP7的表达。5.构建IGFBP7干扰载体pGenesil-si IGFBP7，通过siRNA干扰IGFBP7表达。6.应用不完全弗氏佐剂(IFA)诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成，消化法分离获得LEC，以鼠尾胶为粘贴剂原代培养。淋巴管形成实验判定LEC能否形成管样结构。7.建立LLC与LEC共培养体系，用CCK-8细胞活性实验和Transwell小室细胞迁移实验，分析敲减IGFBP7前后LLC细胞对LEC生长和迁移的影响。8.利用C57BL/6小鼠建立敲减IGFBP7的LLC和未敲减IGFBP7的LLC皮下移植瘤模型，利用免疫荧光和共聚焦显微镜观察肿瘤新生淋巴管情况，分析敲减IGFBP7对移植瘤生长、淋巴管生成、淋巴结转移和肺转移的影响。结果1. Podoplanin阳性淋巴管LVD在5例肺炎性假瘤为10.8±4.3，在34例肺腺癌瘤内为11.2±5.0，肺腺癌瘤周为23.5±8.4，瘤周LVD明显高于前二者(P <0.05)。肿瘤分期N1-2与N0瘤周的LVD分别是24.3±8.7、18.4±6.3，前者明显高于后者(P <0.01)；Ⅰ-Ⅱ期与Ⅲ-Ⅳ瘤周的LVD分别是18.4±5.6、24.1±8.2，前者明显低于后者(P <0.01)。2.按LVD评分对6例肺腺癌新鲜手术标本进行了分组，具体为LVDhigh组和LVDlow组。利用全基因表达谱芯片技术，对两组进行差异性表达基因的筛选。以差异2倍为标准，得到上调基因即促进淋巴管生成的基因94个，下调基因即抑制淋巴管生成的基因81个。我们分别选取IGFBP7、CDH1进行了real time PCR的验证，与表达谱芯片的筛选结果基本一致。3.免疫组化结果显示：97例NSCLC患者中IGFBP7的表达阳性54例，瘤周LVD为23.1±8.5；而IGFBP7的表达阴性的43例，瘤周LVD为16.9±6.0，IGFBP7的表达阳性的瘤周LVD明显高于阴性的瘤周LVD (P <0.05)。淋巴结转移组IGFBP7阳性率(45.2%, 28/62)显著高于无淋巴结转移组(25.7%, 9/35) (P <0.05)。Spearman相关性分析表明，IGFBP7阳性率与LVD呈正相关(r =0.423，P <0.01)。97例NSCLC中CDH1的表达阳性48例，瘤周LVD为21.2±10.4；而CDH1的表达阴性的49例，LVD为17.2±7.9，CDH1的表达阳性的瘤周LVD与阴性的瘤周LVD无显著性差异(P >0.05)。4. RT-PCR检测IGFBP7在人肺癌细胞株和小鼠肺癌细胞株的高表达，在NIH3T3和L929未见表达。5.成功构建了pGenesil-siIGFBP7干扰载体；载体转染LLC细胞可下调IGFBP7表达。6. IFA能诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成，所获LEC活细胞数大于96%，高表达VEGFR-3。在自制鼠尾胶包被的培养瓶(板)中，LEC生长状况良好，在鼠尾胶凝胶中，LEC可形成淋巴管样结构。7.经过对transwell小室的insert外表面的LEC进行HE染色发现，LLC组透膜细胞百分比明显高于LLCSiRNA-IGFBP7组(P <0.05)；LLCSiRNA-IGFBP7百分比明显高于空白对照组(P <0.05)。结果表明，IGFBP7敲减的LLC能够明显增强LEC的迁移能力，但其促进能力小于未敲减IGFBP7的LLC细胞。8. IGFBP7敲减实验表明：pGenesil-siIGFBP7组同侧颈上、对侧颈上及腋窝淋巴结转移率分别为100%、33.3%和66.7%；而未转染组分别为100%、83.3%和100%；空质粒转染组分别是100%、66.7和83.3%。pGenesil-siIGFBP7组腋窝淋巴结转移率明显低于未转染组和空质粒转染组(P <0.05)。pGenesil-siIGFBP7组移植瘤瘤周LVD(9.4±2.3)显著低于未转染组(16.7±3.5)和空质粒转染组(13.2±2.8)转染组(P <0.05)。免疫荧光和共聚焦显微镜显示，移植瘤组织中新生淋巴管多位于瘤周，结构不完整，成窦状。结论1、利用全基因组表达基因表达芯片对LVDhigh与LVDlow组进行了差异性的筛选，差异性筛选出IGFBP7等上调基因94个、CDH1等下调基因81个。2、人肺腺癌组织IGFBP7表达与其LVD呈显著正相关，且淋巴结转移组IGFBP7阳性率(45.2%, 28/62)显著高于无淋巴结转移组(25.7%, 9/35) (P <0.05)；IGFBP7能够促进LEC迁移、淋巴管生成和淋巴结转移。CDH1与肿瘤淋巴管转移无明显相关性。