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由新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒肺炎（Corona virus disease 2019,COVID-19）在全球范围内暴发流行,已造成5亿多人感染,死亡病例超过600万,严重威胁着全人类的生命健康。S蛋白和N蛋白是SARS-CoV-2疫苗研发和抗原检测的理想靶点,建立一种快速、可靠、低成本的SARS-CoV-2抗原定量检测方法,应用于感染患者早期诊断和疫苗研发,对于疫情防控至关重要。本研究采用灭活SARS-CoV-2病毒免疫山羊制备羊抗SARS-CoV-2多抗作为包被抗体,S蛋白或N蛋白作为抗原,杂交瘤细胞培养上清作为待筛选抗体,羊抗鼠酶标抗体作为检测抗体,建立酶联免疫吸附试验（ELISA）单抗筛选体系。通过杂交瘤细胞技术共筛选出29株单克隆杂交瘤细胞株,其中5株为抗N蛋白单抗,24株抗S蛋白单抗中有20株为中和抗体。通过腹水法制备了 15株单克隆抗体,并对单抗进行纯度、浓度、抗体亚型、效价测定以及特异性和稳定性鉴定。用制备的羊多抗作为包被抗体,鼠单抗作为检测抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG作为酶标抗体,分别建立了对S蛋白、N蛋白进行定量检测的双抗体夹心ELISA抗原检测方法,对反应体系进行优化和验证。结果如下:制备了高纯度、高特异性的羊抗SARS-CoV-2多抗,抗体效价为1:51200,浓度为7.34 mg/mL,EC50值为0.143 μg/mL,可特异性识别SARS-CoV-2全病毒、S蛋白和N蛋白,与常见实验室病原体和蛋白交叉反应低,可用于单抗筛选体系和双抗体夹心ELISA抗原检测方法建立。制备了 15株纯度高、特异性强、稳定性好的单克隆抗体,纯化后抗体效价均高于 1:50000,EC50 值达到纳克级。除 S4-B5-D10-A1 为 IgM 类,R2-G4-F6、R2-G4-H12抗体亚型为IgG2a外,其余各抗体均为IgG2b型。纯化后的中和抗体对武汉株活病毒中和滴度大于1:1000。比较各抗体对S蛋白的结合能力,选择亲和力更高的S4-G12-A12-A5作为检测抗体与制备的羊多抗建立了 S蛋白双抗体夹心ELISA检测方法,其最适包被抗体、检测抗体和酶标抗体浓度分别为:2.5 μg/mL、0.05 μg/mL和0.125 μg/mL;最适反应条件为:含1%BSA（w/v）的10 mmol/L PBS 37℃封闭2 h,酶标抗体37℃孵育1 h,TMB底物37℃避光反应15 min。检测S蛋白线性范围为0.78 ng/mL～25 ng/mL,R2=0.9901;检测武汉株灭活全病毒线性范围为1 U～64 U,R2=0.993。该方法具有较高特异性,与SARS-CoV-2 N蛋白、Vero细胞碎片和流感病毒等交叉反应A450值低于0.1;检测样本的敏感性为92.1%,符合率为96.7%;稳定性好,批内和批间变异系数分别为2.5%～11.7%和1.3%～14.8%,可对S蛋白进行定量检测。以对N蛋白亲和力更高的N3-C2-B9-B10作为检测抗体与制备的羊多抗建立了 N蛋白双抗体夹心ELISA方法,方法的最适包被抗体、检测抗体和酶标抗体浓度分别为1 μg/mL、0.3 μg/mL和0.1 μg/mL;最适反应条件为:含2%脱脂奶粉（w/v）的10 mmol/L PBS 37℃封闭2 h,酶标抗体37℃孵育1 h,TMB底物37℃避光反应15 min。检测重组N蛋白线性范围为7.8 ng/mL～1000 ng/mL,R2=0.9958;检测武汉株灭活全病毒线性范围为1 U-128 U,R2=0.9954。该方法检测样本的敏感性为96.875%,特异性良好,与Vero细胞、SARS-CoV-2刺突蛋白、流感病毒等交叉反应A450值低于0.1;批内和批间变异系数分别为2.1%～11.7%和4.3%～11.8%;检测样品回收率在94.3%～104.8%之间。结果表明该方法特异性强、稳定性好、敏感性和准确度高,可用于SARS-CoV-2 NP定量检测。本研究通过SARS-CoV-2武汉株天然病毒免疫山羊制备了羊IgG,建立了应用于单抗筛选的双抗体夹心ELISA方法,优选出多株高特异性的鼠抗S蛋白、N蛋白单克隆抗体和中和抗体,并运用于双抗体夹心ELISA抗原检测方法建立。建立的ELISA方法具有对武汉株全病毒较高的敏感性,能反映待测样本中天然构象的S蛋白、N蛋白的含量,已运用于新冠病毒疫苗中抗原和抗体定量检测。