心肌细胞缝隙连接传递大分子物质及其功能

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【背景】缝隙连接是位于心肌细胞之间闰盘部位的一种非选择性物质交换通道,允许小于1 k Da的小分子物质,例如离子、第二信使分子等通透,实现细胞浆的部分物质交换与信息传递。近年来随着对缝隙连接研究的深入,发现缝隙连接依赖其可以通透物质的特性,参与了多种生理和病理过程,例如缝隙连接可以影响细胞的转录翻译过程,改变蛋白表达水平与种类,促进凋亡信号的扩散,增加心肌梗死面积,影响细胞周期等。用小分子物质的通透很难解释缝隙连接的这些功能,因此,我们推测缝隙连接的通透特性不仅限于小于1 k Da的物质,此通道可能允许大分子物质的通透。本课题采用多种实验方法,系统地研究了缝隙连接的通透特性,以及大分子物质通过缝隙连接在细胞间交换的作用。【目的】(1)获得大量具有功能性缝隙连接的连体心肌细胞。(2)显微注射检测心肌细胞缝隙连接的物质通透性,以及通道孔径。(3)研究缝隙连接对心肌细胞死亡信号和生长信号传递的作用。【方法】本研究主要采用显微注射的方法,将一系列分子量不同、体积不同的荧光分子注入连体心肌细胞内,观察分子的扩散过程,间接测定心肌缝隙连接的通透性及通道孔径尺寸。随后建立在体心肌梗死、离体心肌梗死模型,检测缝隙连接在细胞序贯死亡中的作用;建立心脏肥大模型、新生大鼠原代心肌细胞肥大模型,检测缝隙连接在细胞生长中的作用;构建病毒载体,感染心肌细胞,研究大分子物质经缝隙连接在培养细胞间的扩散过程与作用。【结果】(1)改进实验方法,获得具有功能性缝隙连接的连体心肌细胞酶消化法急性分离成年大鼠心肌细胞,可以获得大量高质量的单个长杆状心肌细胞,缝隙连接结构与功能均遭到破坏,不能满足本实验的要求。为了获得与生理状态基本一致的缝隙连接,本研究通过改变酶消化过程中液体Ca2+浓度,增加液体中Ca2+浓度,并在5~10μmol/L范围内微调,同时全程维持液体的p H值(7.35~7.45)在恒定范围,可以使部分闰盘在消化过程中保持完整,消化结束后获得大量的连体心肌细胞。显微注射荧光分子碘化丙啶(PI,分子量668 Da)和缝隙连接阻断剂octanol孵育细胞,两个实验证实连体心肌细胞间的缝隙连接功能正常,没有受到酶消化处理的影响产生功能失调,因此可以采用酶消化法获得的连体心肌细胞,针对缝隙连接的结构与功能开展下一步的研究。(2)缝隙连接可以通透大分子物质,但是对物质的通透性受到多种因素的影响免疫荧光方法确定心室肌表达的缝隙连接蛋白(connexin)亚型包括Cx40、Cx43、Cx45,心室肌缝隙连接是由12个connexin亚基组成的异源复合体。在现有的实验方法不能直接检测心肌细胞缝隙连接通透性的情况下,本课题采用显微注射荧光分子的方法间接测定缝隙连接的通透性。分别向一个心肌细胞内注射荧光分子10 k Da、40 k Da、70 k Da、150 k Da、250 k Da或2000 k Da的Dextran-FITC,荧光显微镜观察荧光分子在连体细胞间的扩散过程,证实缝隙连接可以通透小于150 k Da的Dextran-FITC,但是随着分子量的增加,荧光分子的扩散速度越来越慢,说明分子量的大小影响物质的通透性;为观测蛋白分子的扩散特性,显微注射红色荧光蛋白(RFP)进入细胞,发现RFP也可以顺利通过缝隙连接,但是扩散速度远远慢于同等分子量的Dextran-FITC,说明物质的电荷数和空间构象也会对物质的通透性产生影响。根据已知荧光分子Dextran-FITC的直径,可以估测出心肌缝隙连接的孔径约为17 nm。(3)缝隙连接可以介导死亡信号和细胞生长信号的传导缝隙连接可以促进死亡信号的扩散。分别构建在体、离体心肌梗死模型,本研究发现在心肌梗死危险区,缝隙连接保持开放,会导致死亡信号从坏死心肌细胞蔓延至存活心肌细胞,细胞结构首先从一端开始破坏,出现肌节Z线附近电子密度降低,线粒体肿胀,肌纤维断裂,逐渐向整个细胞扩散,最终导致整个细胞坏死。再灌注损伤过程中多种因素(缺氧、钙超载、酸中毒)会降低缝隙连接的通透性,促进缝隙连接关闭,可以阻断死亡信号的传递,使存活的心肌细胞得以保持活性,减少死亡细胞数量,降低心肌梗死面积。缝隙连接可以介导生长信号的传递。建立心脏压力后负荷模型-腹主动脉缩窄,分别观察1d、8W、16W的心肌肥厚程度,发现闰盘双侧的心肌细胞生长速度保持一致;肥大因子ET-1刺激新生大鼠原代培养细胞,48 h测定细胞表面积,重点测定保持相互接触的细胞面积,因为这类细胞之间存在缝隙连接,发现相互接触的细胞表面积没有差异,没有相互接触的细胞之间表面积差别很大;结合这两个实验的结果证实,缝隙连接可以介导生长信号的传递,协调细胞之间的生长。构建慢病毒载体感染新生大鼠心肌细胞,发现蛋白分子EGFP从感染病毒的细胞扩散至未被病毒感染的细胞,证实大分子物质增强绿色荧光蛋白(EGFP)可以在相互接触的细胞之间扩散,进一步提供了缝隙连接可以通透大分子物质的证据。【结论】心肌细胞缝隙连接可以通透小于150 k Da的大分子物质,通道孔径大约为17 nm。因为对大分子物质的通透特性,缝隙连接可以介导细胞死亡信号和生长信号的传导,影响细胞的死亡数量,协调细胞之间的生长过程。
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