背景与目的环孢素A(Cyclosporine A,CsA)已广泛应用于异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后的移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)预防和治疗。CsA是一种钙调磷酸酶抑制剂(CNI),作用于钙调依赖性蛋白磷酸酶(PP2B),抑制磷酸蛋白活性,从而抑制T细胞中IL-2等淋巴因子的转录,产生免疫抑制作用。然而,CsA产生效应与出现并发症的血药浓度阈值范围较窄。临床上虽已密切监测,仍不可避免出现并发症,尤其是严重CsA相关神经毒性(severe cyclosporine A-related neurotoxicity, SNCT)的发生,不仅影响其使用,更可能降低移植患者生存率。目前国内外对于SNCT的研究报道相对较少,并未引起重视。本院曾统计2003年至2006年allo-HSCT后SNCT的发病情况及进行相关影响因素分析,但2007年后随着新型三唑类抗真菌药物的使用增加,CsA血药浓度出现更明显的波动变化。目前鲜见单独分析SNCT与新型三唑类药物的报道。分析这部分allo-HSCT患者发生SNCT的危险因素,有助提高SNCT早期诊断的意识,改善其预防措施,从而提高移植后生存率。CsA在药代学方面存在着明显的个体差异。尽管药物监测有助于监测CsA的血药浓度,但因其受到多种因素的影响,个体差异大,且治疗窗口窄,因而维持其高效能和低毒性一直是CsA临床使用面临的巨大挑战。近年来,一些关于CsA相关的药物基因组学研究渐渐受到重视。据估计,20%～95%的药物处置及效应差异与基因多态性有关。多态性(polymorphism)是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(genotype)或等位基因(allele).单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是人类可遗传的变异中最常见的一种,占所有已知基因多态性的90%以上。出现在编码区的SNP可能改变其编码的氨基酸,从而影响了生成的蛋白质及其功能。这种改变常导致机体生物学性状的变化。因此通过对SNP的研究,有助于从基因水平上揭示不同个体间生物学功能存在差异的根本原因。已有报道证实CYP3A5、MDR1G2677T/A基因多态性对CsA的药代动力学存在一定影响。CYP3A5基因的大部分SNPs被发现对表达的蛋白酶具有功能意义。并且CYP3A5*3在中国人中的发生频率为71%～76%。因此多数学者认为CYP3A5的SNPs是CYP系统导致个体间CsA的生物等效性和清除率出现差异的主要原因。但目前大部分报道,对CYP3A5*3基因多态性与CsA药代动力学的研究多集中于移植后3月、6月,甚至更久,可能导致观察的间隔时间太长而无法准确记录CsA药代的变化。因此我们希望在移植早期60d内观察两者关系,观察时间间隔更严密,且与SNCT的发生时间相一致,可能更有助于明确基因多态性、SNCT与CsA药代的相关关系。MDRl第21外显子2677G→T/A为非同义SNPs,碱基序列的改变可使蛋白质序列发生改变,可能影响P-gp的转运功能和改变蛋白表达,从而影响CsA的血药浓度。虽然MDR1G2677T/A的基因多态性对CsA药代动力学的影响已经在许多研究中得到证实,但这些相关性仍存在争议。随着与CsA共同竞争CYP酶的新型三唑类抗真菌药物(伊曲康唑、伏立康唑)更多使用于allo-HSCT患者,CsA血药浓度变化幅度增大,可控难度更高。因此,进一步研究CsA与新型三唑类药物的相互作用,有助于指导临床药物剂量调整。此外,CYP2C19是影响伏立康唑代谢的主要突变基因,CYP2C19酶活性存在显著的个体差异和种族差异,表现为遗传多态性。在东方人群中,造成弱代谢表型最主要的突变基因为CYP2C19*2和CYP2C19*3。检索国内外文献,大多关于CYP2C19影响伏立康唑的代谢以及伏立康唑与CsA相互作用的报道,因此有必要进一步分析allo-HSCT患者使用伏立康唑时CYP2C19基因多态性与CsA药代的关系。目前国内外对于基因多态性与CsA代谢相关性的研究报道多集中在器官移植方面,在异基因造血干细胞移植领域并未引起重视。因此,了解基因多态性与新型三唑类抗真菌药物对allo-HSCT患者CsA浓度影响的研究,有利于根据基因型来确定allo-HSCT患者CsA与新型三唑类药物的初始剂量,探索相关因素影响程度,以指导剂量调整,提高CsA临床效应,制定个体化给药方案。方法一、异基因造血干细胞移植后严重环孢素A相关神经毒性的近五年临床回顾性分析1.病历资料：选择南方医科大学南方医院血液科2008年6月至2013年6月390例接受allo-HSCT后使用CsA并发生SNCT的16例患者。男5例,女11例,中位年龄37(15-51)岁。6例急性淋巴细胞白血病,4例慢性髓系白血病,3例急性髓系白血病,2例骨髓增生异常综合征和1例重型再障。移植时疾病状态：完全缓解(CR)8例,部分缓解(PR)3例,未缓解(NR)5例。移植前诊断中枢神经系统白血病(CNSL)1例,移植后诊断CNSL1例。2.方法：回顾分析allo-HSCT后出现SNCT的16例患者,观察其CsA血药谷浓度、临床表现、影像学特征、影响因素、治疗及转归。随访至2013年7月1日,中位随访时间为8(1-56)月。二、CYP3A5、CYP2C19及MDR1G2677T/A基因多态性对异基因造血干细胞移植患者环孢素A药代的影响1.病历选择：选择南方医科大学南方医院血液科2012年11月至2013年11月接受allo-HSCT并使用CsA的血液病患者60例。其中CsA与新型三唑类药物合用30例(伏立康唑20例,伊曲康唑10例),与非新型三唑类药物合用30例。60例allo-HSCT患者的临床特征(性别、年龄、HLA配型、供受关系、预处理方案和ATG使用等基础状况)构成比与患者allo-HSCT后第7、14、21、30、45、60天CsA的Co/D值的比较均无差异性(P>0.05,范围为0.138～0.613)。2.样本采集：采集allo-HSCT患者移植前的外周静脉血或移植后的口腔粘膜(排除口腔GVHD者),用于基因组DNA提取,共取得外周血样本25例,口腔粘膜样本35例。提取DNA,分装,-20℃保存备用。3.CYP3A5、MDR1G2677T/A及CYP2C19基因多态性的测定：采用聚合酶链反应-限制性内切酶法(PCR-RFLP)和测序方法测定CYP3A5基因6986位点、MDR1G2677T/A基因2677位点、CYP2C19*2基因681位点及CYP2C19*3基因636位点基因多态性。4.统计分析：采用SPSS17.0软件处理。所得计量数据以均数±标准差表示,计量资料数据为正态分布则采用完全随机设计资料的方差分析,对于偏态计量数据的参数,采用两独立样本的非参数检验；多个样本率的比较采用列联表资料分析；两组间比较采用独立样本t检验。显著性界限定为0.05。结果1.4.1%(16/390)的患者出现SNCT,主要表现为症状性癫痫,6例伴高血压,12例伴电解质紊乱,12例出现环孢素浓度升高。16例患者在SNCT发生时的CsA中位血药浓度为472.6(147.4-958.8)ng/ml,其中CsA与新型三唑类药物合用13例。10例接受MRI检查患者中7例显示异常,其中4/16呈现PRES影像,6例脑脊液检查患者中有3例轻度异常。发生SNCT的中位时间为移植后30(13-350)d,其中13/16例发生在60d内,2/16例发生在60-90d,只有一例发生在移植后350d,考虑与加用伏立康唑后引起CsA浓度升高有关。经CsA停药或减量后,11例获得完全恢复,2例部分恢复,3例因SNCT死亡。至2013年7月1日随访中位时间8(1-56)月,16例患者中存活8例,3例因SNCT死亡,2例因肺部混合感染并肺泡出血死亡,2例死于颅内出血,1例死于Ⅳ°aGVHD,死亡中位时间为移植后2(1-7)月,SNCT相关死亡率为18.75%(3/16),16例移植后SNCT患者总生存率为50%(8/16)。2.CYP3A5*3.MDR1G2677T/A、CYP2C19*2及CYP2C19*3基因型的分布频率60例患者测定CYP3A5*3.MDR1G2677T/A基因型,20例使用伏立康唑患者测定CYP2C19基因型。CYP3A5*3基因6986位点*1/*1基因型有11例(18.3%),*1/*3有22例(36.7%),*3/*3有27例(45%);MDR1G2677T/A基因2677位点野生纯合型(G/G)有9例(15%),突变杂合型(G/T+G/A)有39例(65%),突变纯合型(T/T+A/A+A/T)有12例(20%):CYP2C19纯合子快代谢型(*1/*1)基因型有5例(25%),杂合子快代谢型(*1/*2+*1/*3)有9例(45%),慢代谢型(*2/*2+*2/*3+*3/*3)有6例(30%)。经Hard-Weniberg遗传平衡检验,结果显示CYP3A5*3和CYP2C19基因频率达到遗传平衡(P=0.103,P=0.662),P>0.05提示研究资料具有群体代表性。另(?),MDR1G2677T/A实际数和理论数有统计学差异(P=0.018),即不符合Hard-Weniberg遗传平衡检验,考虑样本选择有误差,或者本研究所做的MDRl G2677T/A基因突变点与研究相关的的位点是连锁不平衡的。3.CYP3A5*3、MDR1G2677T/A、CYP2C19基因多态性对allo-HSCT患者CsA药代的关系3.1CYP3A5*3基因多态性与allo-HSCT患者CsA药代的关系携带CYP3A5*3/*3突变型纯合子allo-HSCT患者移植后14d、21d、60d的CsA浓度/剂量×体表面积(Co/D)明显高于CYP3A5*/*1野生型纯合子及CYP3A5*1/*3杂合子(P<0.05)；与CsA浓度变化相对应,整体上可观察到携带CYP3A5*1/*1及*1/*3的CsA给药剂量均高于*3/*3患者,尤其是第21天的CsA给药剂量与CYP3A5*3基因多态性明显相关(P=0.028):CYP3A5*3基因型与患者移植后2个月内CsA相关并发症和aGVHD发生率发生率无明显差别。3.2MDR1G2677T/A基因多态性与allo-HSCT患者CsA药代的关系MDR1G2677T/A各基因型3组患者的6个时间段C0/D值均无明显统计学意义(P>0.05)。此外,突变纯合型(T/T+A/A+-T)、突变杂合型(G/T+G/A)和野生纯合型(G/G)各组与患者CsA相关并发症和aGVHD发生率无明显差异。3.3CYP2C19*2.CYP2C19*3基因多态性与allo-HSCT患者CsA药代的关系携带慢代谢型(*2/*2+*2/*3+*3/*3)allo-HSCT患者移植后21d的C0/D值明显高于纯合子快代谢型(*1/*1)及杂合子快代谢型(*1/*2+*1/*3)(P=0.049)；其余时间段的C0/D值与CYP2C19基因多态性无相关性,但C0/D值最高的仍然是慢代谢型(*2/*2+*2/*3+*3/*3)。3.4新型三唑类与非新型三唑类药物同allo-HSCT患者CsA药代的关系使用新型三唑类药物的allo-HSCT患者移植后30、45d的C0/D值明显高于使用非新型三唑类药物的患者(P=0.007、P=0.009),使用新型三唑类药物的allo-HSCT患者移植后21、30、45、60d的CsA给药剂量明显高于使用非新型三唑类药物的患者(P<0.05)。此外,两组间CsA相关并发症和aGVHD发生率均无明显差异。结论1.SNCT是allo-HSCT后一种少见的并发症,MRI和电解质指标可协助快速诊断；CsA与新型三唑类药物合用时多出现血药浓度偏高,应严密监测CsA的浓度；提高SNCT早期诊断的意识与积极处理移植相关并发症,加强对症支持治疗,可能有助减低SNCT相关死亡率。2.CYP3A5*3基因多态性与allo-HSCT患者早期CsA的C0/D值具有相关性,CYP3A5*3/*3患者移植后14d、21d、60d的C0/D明显高于CYP3A5*1/*1及*1/*3基因型患者。移植前对患者进行CYP3A5*3基因分析,将会帮助临床医生依据基因型的差异考虑应用不同的CsA初始给药剂量,制定个体化给药方案。3.MDR1G2677T/A基因多态性对CsA药代的影响未能得到证实,今后应在更大的样本人群中及更广泛的SNPs进行研究。4.CYP2C19通过影响伏立康唑的代谢,两药合用时在移植后21d携带慢代谢型患者CsA的C0/D值明显高于纯合子快代谢型及杂合子快代谢型；5.使用新型三唑类药物的allo-HSCT患者移植后30、45d的Co/D值明显高于使用非新型三唑类药物的患者,尤其于移植后30d内同时使用此两类药物时,更需严密监测CsA的血药浓度,慎防出现CsA浓度偏高而导致SNCT的发生。