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促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)是Tsutsui等人于2000年在鹌鹑下丘脑内分离得到的一种神经肽,因其对垂体前叶促性腺激素的释放有抑制作用而得名。GnIH通过其天然的内源性受体GPR147和GPR74发挥生理功能,对动物生殖、行为、摄食及应激等均有调控作用。到目前为止,关于GnIH对家畜生殖功能调节方面的研究报道较少,并且文献中未见有GnIH对公猪生殖调控的研究报道。因此,本文以小梅山公猪为研究对象,通过半定量RT-PCR、免疫组织化学、细胞培养和放射免疫测定等方法研究了小梅山公猪生殖轴GnIH及其受体的生后发育性变化。一、小梅山公猪生殖轴GnIH及其受体mRNAs的生后发育性变化本实验采用半定量RT-PCR技术,对15头不同日龄(3d、30 d、60 d、90 d、120 d, n=3)小梅山公猪下丘脑、垂体和睾丸中GnIH及其受体mRNAs表达的变化规律进行了研究。结果如下：1. GnIH及其受体mRNAs在不同日龄小梅山公猪下丘脑的表达呈现规律性波动且表达模式相似。GnIH及其受体mRNAs均在3 d表达丰度最高,到30 d表达丰度显著下降,在60 d表达丰度升高,然后持续下降,到120 d表达丰度最低。2. GnIH及其受体mRNAs在不同日龄小梅山公猪垂体的表达也呈现规律性波动且它们的表达模式基本相似。GnIH和GPR147 mRNAs的表达呈现先升高后降低的趋势,其中60 d表达丰度最高,3 d表达丰度最低。而GPR74 mRNA的表达呈现持续降低的趋势,3 d表达丰度最高。3. GnIH及其受体mRNAs在不同日龄小梅山公猪睾丸的表达呈现规律性波动但各不相同。GnIH和GPR147 mRNAs表达模式几乎完全相反,GnIH mRNA的表达呈现先降低后升高的趋势,在30 d表达丰度最低；而GPR147 mRNA的表达是先升高后降低的趋势,在30 d表达丰度最高。GPR74 mRNA的表达呈现先降低后升高再降低的趋势,其中90 d表达丰度最高,120 d表达丰度最低。二、GnIH在小梅山公猪下丘脑、垂体和不同日龄睾丸的分布定位本实验采用免疫组织化学法对GnIH在小梅山公猪下丘脑、垂体及不同日龄睾丸中的分布定位进行系统的研究。结果如下：1. GnIH免疫阳性神经元在下丘脑主要分布于室旁核,呈纺锤形或多角形,可见明显的轴突和树突。2. GnIH免疫阳性细胞在垂体分布广泛,无论是腺垂体还是神经垂体均有强烈的免疫阳性反应。3. GnIH免疫阳性细胞在不同日龄的睾丸曲细精管内(支持细胞和生精细胞)均有分布,而在睾丸间质细胞的分布只出现在60～90 d。三、GnIH对体外培养睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制研究为了探讨GnIH对体外培养睾丸间质细胞睾酮分泌的影响及机制,本实验采用细胞免疫组织化学法、半定量RT-PCR法及放射免疫法,研究不同剂量(10-6～10-12 M)GnIH对体外培养睾丸间质细胞睾酮分泌和相关基因3β-HSD和P450表达的影响。结果如下：放射免疫测定结果显示,10-8M GnIH组能极显著抑制睾酮的释放,而10-6、10-10和10-12M GnIH对睾丸间质细胞分泌睾酮均无显著抑制作用。PCR检测结果显示10-8、10-10和10-12M GnIH均可以极显著抑制3p-HSD mRNA的表达,10-8和10-10M GnIH均可以极显著抑制P450 mRNA的表达。以上试验分别在基因、蛋白以及细胞水平为研究GnIH对小梅山公猪生殖调控的作用机制提供了研究依据。