猪卵母细胞体外成熟和体细胞核移植的研究

来源 :广西大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ieksmc
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本文分为以下几个部分进行探讨:  1.系统探讨了猪卵母细胞来源及成熟培养时间对其体外成熟和孤雌激活的影响。结果显示:(1)当猪的卵巢较大、色泽较深、有黄体或大卵泡多的时候,抽取的卵母细胞成熟质量较好,与色泽浅、少或缺黄体的小卵巢相比,成熟效果有显著差异(2)卵巢回收时间对猪卵母细胞的体外成熟有较大影响,在屠宰后0~1 h回收卵巢,猪卵母细胞的体外成熟质量明显好于6h时回收卵巢(3)卵巢保存温度对猪卵母细胞的体外成熟极度重要,猪卵母细胞对温度非常敏感,温度较低时,猪卵母细胞整体发育质量较差(4)猪卵母细胞的体外成熟时间较长,从24h~72h,随着时间的延长,极体率逐渐上升,较为理想的体外成熟时间是46~48h(5)卵巢上卵泡的大小对猪卵母细胞的体外成熟相当重要,较小的卵泡里的卵母细胞处于较低的发育时期,与较大卵泡里的卵母细胞相比较,整体成熟质量较差(6)在COCs中,卵丘结构的完整性与否,对猪卵母细胞的体外成熟有显著影响。  2.探讨了猪卵泡液、OCS、FCS、LH、FSH等因素对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活的影响。结果显示:(1)猪成熟培养液中添加5%猪卵泡液获得42.0%、34.3%的第一极体率和桑椹胚/囊胚率,显著高于对照组的33.7%、24.6%;(2)5%猪卵泡液添加在培养液中,能够提高D16的存活率(15.7%),显著高于对照组(7.2%),说明一定时间内能够延缓猪卵母细胞的衰老;(3)在猪卵母细胞体外成熟过程中,可添加3%~10%的发情牛血清;(4)从第一极体率、分裂率和桑椹胚/囊胚率看,5%0CS和5%FCS对猪卵母细胞体外成熟没有明显的差别。(5)猪卵母细胞体外成熟过程中,与对照组相比,添加10μg/mlLH可提高卵母细胞孤雌激活分裂率;(6)与对照组相比在成熟液中添加5μg/ml~20μg/ml的FSH对猪卵母细胞体外成熟过程无显著影响;(7)在成熟液中添加5%pFF+10μg/mlLH,能够较好地提高猪卵母细胞的第一极体率;(8)在体外成熟液中添加5% pFF的同时,添加7% OCS或10%FCS可获得32.6%、21.6%的桑椹胚/囊胚率,彼此之间差异显著。  3.探讨了猪卵母细胞激活方式对体细胞核移植的影响。结果显示:(1)5μmol离子酶素处理猪体外成熟的卵母细胞5min、7min、9min结合2mmol六甲基氨基嘌呤处理3h分别获得68.7%、63.6%、60.9%的孤雌激活分裂率,均显著高于用5μmol离子酶素仅处理3m获得的46.4%孤雌激活分裂率,差异显著,但四组在桑椹胚/囊胚率上未表现出显著差异。(2)先用5μmol离子酶素处理猪体外成熟的卵母细胞5min,然后用2mmol六甲基氨基嘌呤分别处理1h、3h、5h、7h,获得的孤雌激活分裂率为66.7%、70.6%、64.8%、71.5%,桑椹胚/囊胚率分别为25.0%、25.2%、26.2%和28.0%,彼此之间无显著差异。(3)经过体外成熟的猪卵母细胞使用5μmol离子酶素处理5min结合2mmol六甲基氨基嘌呤处理3h,无论是否出现第一极体,其孤雌激活的分裂率和桑椹胚/囊胚率均不产生显著影响(4)使用5μmol离子酶素或7%乙醇对猪卵母细胞进行孤雌激活,在分裂率及桑椹胚/囊胚率均不显示显著的差异(5)进行猪体细胞核移植时,去核比例不能太高,应当控制在1/4以内,否则会对激活后的分裂率造成显著的差异(6)在猪卵母细胞体外成熟液中添加5%OCS或5%FCS,对核移植的结果没有显著差异。  4.首次探讨了马尾藻属藻类多糖对猪卵母细胞体外成熟、存活率和体细胞核移植的影响。结果显示:(1)体外培养46~48h时,成熟液添加马尾藻属藻类多糖能促进卵丘细胞扩展,添加20mg/ml马尾藻属藻类多糖能提高核成熟率(41.8%),与对照组29.3%的核成熟率相比,二者差异显著;(2)添加马尾藻属藻类多糖可延长猪卵母细胞体外存活时间,体外培养到D16,含0mg/ml、5mg/ml、20mg/ml马尾藻属藻类多糖的猪卵母细胞存活率分别为2.6%、18.9%、23.0%,添加与否差异显著;(3)猪卵母细胞的成熟液中添加马尾藻属藻类多糖,能提高核移植后的分裂率,差异显著。  5.首次探讨了人参皂甙对猪卵母细胞体外成熟、存活率和体细胞核移植的影响。结果显示:(1)体外培养46~48h时,400μg/ml人工培育人参皂甙对猪卵母细胞的体外成熟有显著的影响,可获得66.0%孤雌激活分裂率;(2)添加400μg/ml人工培育人参皂甙可延长猪卵母细胞体外存活时间,体外培养到D13时,仍然可获得46.6%的存活率,与对照组31.0%存活率比较差异显著;(3)在猪卵母细胞体外培养液中添加400μg/ml人工培育人参皂甙对猪体细胞核移植的不存在显著的影响。
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