微腔式数字PCR芯片研究及应用

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核酸定量技术是生命科学领域的一项重要技术,通过对核酸含量的测定,不仅可以判断生物体生理病理的变化,而且对基因表达、药效评价和致病基因检测等研究具有重大价值。数字聚合酶链式反应(dPCR)技术是一种对核酸的绝对定量和突变检测的有效手段,现有的dPCR平台受限于昂贵的设备和复杂的操作,无法真正推广应用。本文针对已有技术的不足,将dPCR技术与微流控技术相结合,提出了一种操作简单和性能可靠的“自吸入”微流控芯片。主要的研究结果如下:  1.根据dPCR的技术原理和微流控芯片的流体理论,设计出一种基于柱形微腔的dPCR芯片,利用微纳加工技术和高分子聚合材料软刻蚀工艺完成了芯片的制备;  2.利用PDMS高空气溶解率的特性,真空脱气后的PDMS芯片和泵块为芯片提供动力,实现自动化样品导入和油相分离微腔的过程,简化了芯片的操作,消除了外部设备的使用;  3.针对PDMS材料表面疏水性会强烈吸附蛋白质导致PCR扩增失败的问题,本文提出直接在未固化的PDMS中掺入表面活性剂TritonⅩ-100制作SDP(surfactant doped PDMS)芯片,并从实时检测混合材料表面接触角、导入荧光素标记的抗体溶液(CD45-FITC)和dPCR芯片反应三个方面验证了SDP芯片对蛋白质非特异性吸附的抑制作用,结合材料透光率与掺杂浓度的关系,最终确定在PDMS里掺杂0.5%的TritonⅩ-100;  4.PDMS的高空气溶解率特性带来了高速水分蒸发的负作用,本文提出了“玻璃-薄PDMS-玻璃”夹心结构,抑制SDP芯片微结构中水分的蒸发;  5.以定量的培养细胞基因组DNA抽提产物为检测对象,测定了dPCR芯片的绝对定量能力,与qPCR相比,dPCR芯片在拷贝数101-105间呈现更佳的线性关系(R2=0.9996),在微小拷贝数差异检测方面,dPCR能区分1.2倍的差异(R2=0.9896),qPCR仅能区分1.5倍的差异(R2=0.9341);  6.在柱形微腔式dPCR芯片的基础上,提出了液滴储存更稳定、微腔集成度更高的球形微腔式dPCR芯片,并验证其片上扩增的功能。
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