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赤霉素分子(Gibberellins,GAs)作为二萜类植物激素在植物生长发育过程中起着非常重要的作用,如促进植物茎秆的伸长、叶片的伸展、种子的萌发、植物的开花以及果实的发育等。GA的生物合成与代谢和GA在植物体内的信号转导密切相关,并且与体内其他激素的信号相互整合,形成复杂的调控网络,共同调节植物的生长发育以及植物对环境因子变化的应答。本文前期的研究表明水稻EUI编码一个新的P450单加氧酶,EUI蛋白通过16-α,17环氧化反应催化非13-羟化途径中的GA分子(GA4、GA9和GA12),降解水稻体内活性GA分子和前体分子。后续的研究表明EUI不仅参与了水稻中GA的代谢途径,而且还影响了GA的信号途径。
本文对拟南芥两个EUI homolog基因(AtEUIla,AtEUIlb)的功能进行了系统的研究。结果表明,AtEUIla和AtEUIlb T-DNA插入单突变与野生型比较,没有明显的表型差异;Ateuila RNAi/Ateuilb双突变导致植株发育发生明显的变化,从种子,子叶,莲座叶,以及花和果荚在表观上都比野生型显著变大;AtEUIl基因的过表达能导致严重的矮化表型。形态观察也发现,Ateuila RNAi/Ateuilb双突变和AtEUIl基因的过表达改变了植物许多的发育过程。叶片的解剖结构以及扫描电镜图显示AtEUIl基因负向调节了细胞的分裂和伸长。利用GUS报告基因发现AtEUIl基因具有组织表达特异性;并且通过AtEUIla-GFP,AtEUIlb-GFP和AtEUIlb-RFP融合蛋白对其进行亚细胞定位,结果表明这两个蛋白定位在内质网上。
通过不同外源GAs处理,与野生型相比,AtEUIl基因的过表达株系对外源GA12不敏感,而对外源GAI、GA3、GA4和GA9敏感。结果暗示AtEUIl蛋白可能主要以GA12为底物参与到GA合成代谢过程中。
为进一步分析AtEUIl的生化功能,本研究与国外合作,利用酵母的异源表达和体外生化分析证明了AtEUIl的生化功能,结果显示其与OsEUI的生化功能不同,AtEUIla蛋白能通过17-α氧化反应催化GA12形成17-α COOHGA12;AtEUIlb蛋白能通过12-α羟化反应催化GA12-CHO和GA12分别形成12-α OH GA12-CHO和12-α OHGA12。因为GA12是产生活性GA的节点底物,这些催化反应降低了拟南芥中活性GA的含量。结果表明, AtEUIla和AtEUIlb通过调控GA12的含量来控制活性GA的水平,这是首次发现的GA12专化性氧化酶,其控制了一条新的GA代谢的通路,填补了整个GA合成代谢通路关键节点的空白。甜菊糖苷生物合成过程与赤霉素的生物合成密切相关,它们具有共同前体物质内根贝壳杉烯酸。本研究也发现AtEUIlb可以作为内根-贝壳杉烯酸13-羟化酶(ent-kaurenoie acid 13-hydroxylase)/GA13 oxidase转化内根-贝壳杉烯酸为甜菊醇(steviol)。将AtEUIla,AtEUIlb两个基因分别在水稻中进行过量表达,结果显示超表达AtEUIla植株株高降低且存在梯度变化,这种梯度变化是由体内AtEUIla不同的表达水平引起的,而且矮化程度比较严重,严重影响了水稻结实率。AtEUIlb超表达虽然也影响株高的梯度变化,但矮化程度均较弱,并且分蘖数明显增加,单株结实率也增加,因此AtEUIlb的异位表达对水稻具有明显的增产效果,可能具有较好的分子育种应用潜力。