根癌农杆菌铁蛋白编码基因bfr和dps的功能研究

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根癌农杆菌是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阴性植物病原菌,可在自然条件下感染140多种双子叶植物,导致宿主植物发生冠瘿瘤疾病。根癌农杆菌在侵染宿主植物时可将自身的T-DNA转移并整合到宿主的基因组中使宿主发生遗传转化,当T-DNA所携带的基因在宿主中表达后,宿主植物就发生冠瘿瘤疾病。根癌农杆菌这种能使宿主植物发生遗传转化的能力使之成为最有效的植物转基因工具。  铁是生物所必需的微量元素之一,铁蛋白在维持细胞的铁平衡中起着重要作用,在铁过量的情况下可在细胞内储存多余的铁,防止芬顿反应(Fe2++ H2O2→Fe3++OH-+·OH)的发生,在细胞缺铁的情况下,又可释放其储存的铁,满足细胞生长的需要。已有研究表明植物病原菌的致病性和铁蛋白紧密相关,通常细菌细胞有Ftn、Bfr和Dps三类铁蛋白,然而根癌农杆菌中只含有两个铁蛋白编码基因bfr和dps,根癌农杆菌这种独特的铁蛋白基因组合类型和功能特点值得深入研究。  本论文通过构建根癌农杆菌bfr和bps基因的一系列缺失突变体菌株及回补菌株,测定了各菌株的生长状态、抗氧化胁迫能力、致病性以及bfr和dps基因的表达调控机制来综合分析根癌农杆菌中铁蛋白的生理功能及其互作关系,并在此基础上探讨根癌农杆菌的铁蛋白与其他植物致病菌株中铁蛋白的异同点。  通过本论文的研究取得了下列结果:(1)对野生型根癌农杆菌、dfr和dps基因缺失突变体以及它们的回补株生长曲线的测定,发现在营养成分较丰富的培养基中,bfr和dps基因缺失突变体的生长速度与野生型和回补株相比,没有明显的区别;而在营养成分较匮乏的培养基中,bfr基因缺失突变体的生长速度明显小于野生型和回补株,dps基因缺失突变体的生长速度与野生型和回补株相比,没有明显的区别。这说明野生型根癌农杆菌铁蛋白编码基因bfr在贫瘠的生长条件下可能对细胞生长发挥着重要作用,而dps对细胞生长的影响不明显;(2)研究了bfr和dps基因缺失对根癌农杆菌细胞抗氧化胁迫能力的影响,在固体培养基中加入不同终浓度的H2O2,发现bfr基因缺失突变体的生长明显弱于野生型和回补株,这说明铁蛋白编码基因bfr能够增强根癌农杆菌细胞的抗氧化胁迫能力,以同样的方法检测dps的功能发现此基因对细胞抗氧化胁迫能力无明显影响;(3)bfr基因缺失对根癌农杆菌细胞致病性的研究,将野生型根癌农杆菌、bfr基因缺失突变体以及它的回补株接种于植物的受伤叶片上,培养一段时间后发现bfr基因缺失突变体对受伤叶片的致病性明显弱于其他两种菌株,这说明铁蛋白编码基因bfr的功能与根癌农杆菌的致病性息息相关;(4)通过细菌双杂交实验发现Bfr和Dps铁蛋白存在互作,利用RT-PCR技术发现编码铁蛋白的基因缺失后,其他与铁代谢相关基因的表达量是降低的,而与氧化胁迫相关基因的表达量却是增加的。这些结果表明,铁蛋白编码基因bfr和dps对野生型根癌农杆菌生长、抗氧化胁迫、致病性等各个方面都有着重要和独特的作用,这有助于进一步阐明根癌农杆菌复杂的致病机理,并可能在开发更高效的转基因工程菌株方面具有重要的学术价值和应用潜力。
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