我国是全球结核病高负担国家之一,我国结核病患病人数居全球第三,结核病是我国重点控制的四个重大传染病之一,结核病尤其是耐药结核病的流行对我国经济发展和人民的健康造成了严重威胁。结核病疫情主要是由结核分枝杆菌北京基因型菌株所致,约占62%。近年来,我国已经采取了许多卓有成效的措施来控制结核病,然而当前结核病依然是我国严重的公共卫生问题和社会问题之一。为进一步有效控制结核病,降低患病率和死亡率,需要对结核病之致病菌——结核分枝杆菌的遗传变异、进化和结核病的流行规律等进行研究,了解北京基因型菌株的遗传特征及传播规律对有效防控结核病具有积极的促进作用。目前我国在结核病控制领域还有诸多的问题未进行系统的研究,比如我国结核分枝杆菌主要流行株的起源、进化和流行规律不明确,具有中国代表性的结核病耐药相关基因的突变规律不清晰,尚未建立我国结核病发病和传播的数学模型,对于我国结核病主要流行株的毒力、致病性和耐药性等生物学特性以及流行和传播规律缺乏系统的研究。如若能对于上述问题进行深入研究,将会为进一步修订和完善我国结核病防治策略提供科学的依据,对结核病防控措施的实施具有指导作用。目的通过基于人群的结核分枝杆菌基因分型研究,进一步验证和确定我国结核病的主要流行株,验证评估适合结核分枝杆菌北京基因型菌株的分型方法;通过全国横断面以及部分地区动态监测等研究,了解结核分枝杆菌北京基因型菌株的流行及传播规律,为我国(尤其是北京基因型菌株广泛流行的地区)结核病防控策略的制定提供科学依据;分析北京基因型表型耐药与基因型的相关性,探索北京基因型及其亚型的区分对临床上抗结核药物使用的指导作用;通过全基因组测序分析北京基因型与传播力相关的遗传特征,探索其流行与传播的遗传机制。方法1.对收集自全国31个省共70个监测点的结核分枝杆菌进行单核苷酸多态性(SNP)检测,通过与散在分布重复单位-数目可变串联重复序列方法(VNTR-15以及VNTR-24)的分型效果做比较,评价联合SNP以及VNTR-15的基因分型方法对结核分枝杆菌北京基因型菌株传播的追踪能力。2.应用联合SNP分型以及VNTR-15分型的方法,在全国范围内分析北京基因型菌株的流行及其影响因素。3.应用联合SNP分型以及VNTR-15分型的方法,地区性(连续3年)动态监测北京基因型菌株流行规律的传播机制。4.应用固体药敏法检测结核分枝杆菌的耐药表型,应用联合SNP分型以及VNTR-15分型的方法对我国四川省结核分枝杆菌进行分型,并分析基因型与耐药的相关性。5.应用全基因组测序技术了解成簇北京基因型菌株的遗传特征,分析遗传机制对其广泛流行及传播的作用。结果1.对于北京基因型菌株,联合SNP以及VNTR-15基因分型方法的分辨力(HGI=0.9950)比 VNTR-15 的分辨力(HGI=0.9915)以及 VNTR24 的分辨力(HGI=0.9943)高;对于现代北京基因型菌株,其分辨力(HGI=0.9917)同样比 VNTR-15 的分辨力(HGI=0.9859)以及 VNTR24 的分辨力(HGI=0.9905)高;对于古代北京基因型菌株,VNTR24的分辨力(HGl=0.9989)高于联合SNP以及VNTR-15基因分型方法的分辨力(HGI=0.9980)以及VNTR-15的分辨力(HGI=0.9978)。2.结核分枝杆菌北京基因型菌株在全国的流行率为73.69%(1731/2349),其中现代北京基因型菌株在全国的流行率为76.43%(1323/1731),古代北京基因型菌株在全国的流行率为23.57%(408/1731),优势菌株为现代北京基因型菌株。通过单因素分析,结果显示北京基因型及其亚型菌株在全国范围内分布不均匀(P<0.001;P<0.001)。北京基因型菌株比非北京基因型菌株的传播力强(P<0.001);现代北京基因型菌株比古代北京基因型菌株的传播力强(P<0.001)。此外,北京基因型菌株的流行与MDR(P=0.028)以及链霉素耐药(P<0.001)存在正相关性。3.我国四川省结核分枝杆菌北京基因型菌株的流行率为55.51%(489/881),其中现代北京基因型菌株的流行率为70.96%(347/881),古代北京基因型菌株的流行率为29.04%(142/881),优势菌株为现代北京基因型菌株。四川省各地区北京基因型及其亚型菌株的流行无统计学差异(P=0.117;P=0.311)。北京基因型菌株在复治患者中感染率更高,大约是非北京基因型菌株感染率的2倍(P=0.009,OR=1.984);北京基因型菌株更易发生近期传播,近期传播力约是非北京基因型菌株的3倍(P=0.005,OR=2.880)。比较现代北京基因型与古代北京基因型的感染情况,结果显示相对于女性结核病患者,男性患者更容易感染现代型北京菌株(p=0.035);不同年龄分组之间的病人,其感染现代北京基因型菌株以及古代北京基因型菌株的概率具有差异性(P=0.007)。不同年份之间北京基因型及其亚型菌株的流行率无明显变化(P=0.621;P=0.739);该地区2015年北京基因型菌株的近期传播率比2013年和2014年高;Bmyc10亚型在北京基因型菌株中占绝对优势。4.我国四川省结核病患者中,男性患者相对于女性患者更容易产生利福平耐药(P=0.034)以及耐多药现象(P=0.024)。另外,发生近期传播(成簇)的患者更容易发生利福平耐药(P=0.007)、乙胺丁醇耐药(P=0.007)以及耐多药(P=0.002)。该地区北京基因型菌株相对于非北京基因型菌株更容易发生利福平耐药(P=0.038)、异烟肼耐药(P=0.036)、乙胺丁醇耐药(P=0.003)以及耐多药(P=0.006),说明四川地区流行的北京基因型菌株和耐药存在正相关性。亚型Bmyc210与亚型Bmyc10的菌株在SM耐药、INH耐药、RFP耐药以及MDR之间存在统计学差异。5.东亚分枝(北京基因型家系)的SNP及InDe1检出情况明显高于其他分枝;北京基因型菌株SNP热点区域主要分布在PE/PPE蛋白家族相关基因上;北京基因型菌株与H37Rv标准株遗传进化距离相隔比较远;现代北京基因型菌株间遗传距离较近,古代北京基因型菌株间遗传距离较远。结论1.VNTR分型与SNP分型对北京基因型菌株流行与传播规律的研究中具有互补性,联合SNP和VNTR-15的分型方法对结核分枝杆菌北京基因型及其现代亚型菌株具有较高的分辨力。建议使用联合SNP分型以及VNTR-15的基因分型方法在北京基因型菌株或者现代北京亚型菌株占优势的地区,用于追踪其近期传播模式和危险因素分析。在古代北京基因型菌株占主要流行株的地区,建议使用VNTR-24分型方法。2.本研究证明了现代北京基因型菌株是我国的优势菌株;北京基因型及其现代亚型在全国不同地区的分布不同;北京基因型菌株与SM耐药性以及MDR具有正相关性,且更具有扩散的潜在能力,提示北京基因型菌株可能存在耐药与传播的双重优势。同时,现代北京基因型菌株以及古代北京基因型菌株之间的传播潜力以及链霉素耐药性存在统计学差异,其中现代北京基因型菌株具有正相关性,更存在优势。3.结核分枝杆菌现代北京基因型菌株是四川省流行的优势菌株;北京基因型菌株同时与成簇和耐药性具有正相关,表明该地区北京基因型菌株具有双重优势,耐药为其提供了更长传播感染的时间优势;男性患者、具有耐药现象的患者是近期传播(成簇)的危险因素;Bmyc10亚型比其他北京基因型菌株更容易发生近期传播,其由基因突变积累的表型变化可能是其适应性增强的原因。4.我国四川省结核分枝杆菌分离株对异烟肼、链霉素、利福平、乙胺丁醇、氧氟沙星、卡那霉素存在不同程度的耐药现象;除达州大竹县外,其余4个监测点原发性耐药结核病的比重高于获得性耐药结核病;与非北京基因型相比,北京基因型菌株与利福平耐药、异烟肼耐药、乙胺丁醇耐药以及耐多药具有正相关性;Bmyc210亚型菌株更容易发生SM、INH、RFP耐药以及MDR。5.北京基因型菌株在PE/PPE蛋白家族区域存在高发突变,或许是其逃避宿主免疫系统,增强致病性和毒性的遗传机制,造成广泛流行的原因。现代北京基因型菌株与古代北京基因型菌株相比,是相对近期进化而来的亚型,可能更容易发生传播(成簇)。