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目的:复制皮肤肌肉切口牵拉(SMIR)术后持续性疼痛模型,动态观察SMIR术后持续性疼痛模型大鼠脊髓背角胶质细胞活化的变化,研究鞘内注射(i.t)NF-κB抑制剂PDTC(pyrrolidine dithiocarbamate)对SMIR术后持续性疼痛大鼠疼痛行为学及脊髓TNF-α、IL-1β含量的影响。
方法:(1)36只雄性SD大鼠随机分为空白对照(control)组、假手术(sham)组和SMIR模型组,按Flatters法制作大鼠SMIR术后持续性疼痛模型,于术前及术后第1d、3d、7d、12d、22d、32d用机械性缩足反射阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)来评价疼痛行为学变化,电镜观察术后第12d隐神经损伤情况。(2)96只雄性SD大鼠随机分为sham组和SMIR模型组,分别于假手术或SMIR术前及术后第1d、3d、7d、12d和22d应用免疫组织荧光实验观察脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖活化情况,Western blotting法观察脊髓NF-κB p65的表达变化。(3)150只雄性SD大鼠随机分为sham组和SMIR模型组,按鞘内给药不同将sham组分为sham+i.t生理盐水组(无菌生理盐水/10μl i.t,组Ⅰ)和sham+i.tPDTC10g组(PDTC10ng/10μl i.t,组Ⅱ)2个亚组,SMIR模型组分为SMIR+i.t生理盐水组(无菌生理盐水/10μl i.t,组Ⅲ),SMIR+i.t PDTC2ng组(PDTC2ng/10μli.t,组Ⅳ)和SMIR+i.t PDTC10ng组(PDTC1Ong/10μl i.t,组Ⅴ)3个亚组,按Yaksh法鞘内置管,按Flatters法建立SMIR模型,于术前及术后第1d、3d、7d、12d、22d应用MWT评价大鼠疼痛行为学变化,用酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbcnt assay,ELISA)观察大鼠脊髓IL-1β和TNF-α含量的变化。
结果:(1)疼痛行为学结果显示:与术前及control组比较,SMIR模型组术后第1d、3d、7d、12d、22d MWT均显著降低(P＜0.05):而sham组在各时间点MWT无明显区别:整个观察过程中sham组及SMIR模型组大鼠TWL均无显著变化;与SMIR+i.t生理盐水组(组Ⅲ)比较,i.t PDTC10ng(组Ⅴ)大鼠在术后第7d、12d、22d MWT均明显升高(P＜0.05),而i.t PDTC2ng(组Ⅳ)大鼠MWT无显著差异;sham+i.t PDTC10ng(组Ⅱ)与sham+i.t生理盐水组(组Ⅰ)比较,两者各时间点MWT均无明显差异。(2)电镜下观察隐神经损伤结果显示:SMIR术及假手术后隐神经均未出现髓鞘肿胀或脱髓鞘等神经损伤现象。(3)免疫荧光化学结果显示:与术前基础值比较,术后各时间点大鼠脊髓背角小胶质细胞和星形胶质细胞的数量和形态,sham组无显著性差异,术后第3d SMIR模型组大鼠脊髓背角小胶质细胞的数量显著增加,胞体突起增生肥大,呈激活状态,有显著性差异(P＜0.01);术后第3d脊髓背角星形胶质细胞始增加,于术后第12d时数目增加最为显著(P＜0.01),细胞呈显著激活。(4)Western blotting法测定NF-κB p65蛋白表达量变化结果显示:与术前基础值比较,SMIR术后第1d大鼠脊髓即出现表达显著增加(P＜0.01),第3d、7d较术后第1d有所降低,但仍较术前增加(P＜0.05);而sham组大鼠各时间点无统计学意义。(5)ELISA测定脊髓IL-1β和TNF-α含量的变化:与术前基础值相比,各时间点中sham组各亚组脊髓IL-1β和1NF-α含量均无显著性差异,而SMIR模型组各亚组大鼠的脊髓IL-1β和TNF-α含量分别于术后第3d和第7d始明显增加(P＜0.01),其中与组Ⅲ与组Ⅳ比较无显著性差异,而组Ⅴ与组Ⅲ比较脊髓IL-1β和TNF-α含量均明显较低(P＜0.01)。
结论:在本实验条件下,大鼠SMIR术后表现出持续性机械痛觉过敏;脊髓小胶质细胞及星形胶质细胞的激活与SMIR术后持续性疼痛的产生及维持有关;脊髓NF-κB的活化与SMIR术后持续性疼痛的发生发展有关,其机制可能通过促进细胞因子IL-1β,TNF-α的释放而发挥作用。