空肠弯曲杆菌的分离鉴定及其生物膜形成的研究

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空肠弯曲杆菌对食品安全和人类以及动物健康形成了很大的威胁,感染此菌可引发的细菌性肠炎、动物腹泻和流产,或诱发人类神经系统疾病等。事实证明空肠弯曲杆菌在传播过程中由于受到生存环境的压力,多以生物膜形式存在,但是国内尚无关于空肠弯曲杆菌生物膜建立及其生物膜耐药性方面的研究。为证实空肠弯曲杆菌生物膜的存在,并探讨实验室条件下体外构建空肠弯曲杆菌生物膜的最佳方法,以及对比浮游型细菌与生物膜菌的耐药情况,本实验首先根据国标GB/T4789.28-2003、SNO175-92对由猪盲肠内容物分离出的可疑菌进行常规生化检测,初步鉴定的阳性菌样进一步进行PCR定性检测;然后采用试管法对分离菌和标准菌在不同环境因素下进行生物膜形成能力的检测,探究不同气体成份、温度、pH和培养基对空肠弯曲杆菌生物膜形成的影响;其次,以不锈钢针、盖玻片、医用输液管为载体,构建空肠弯曲杆菌的体外模型,通过光学显微镜和扫描电镜(SEM)观察在三种载体上生物膜形态:最后,以标准菌为质控菌,采用美国临床实验室标准协会(CLSI)推荐的肉汤稀释法检测分离菌对8种抗生素的耐药性,同时根据ASTM E2799-2011通过卡尔加里生物膜发生装置(MBEC)对分离得到的空肠弯曲杆菌生物膜进行药物敏感性研究。结果表明:112份猪盲肠内容物直接划板,通过常规生化检测,其中6份为阳性,其中2份经PCR定性检测可确认为空肠弯曲杆菌,此菌在改良Camp-BAP培养基上生长出典型空肠弯曲杆菌菌落,这说明结合焦性没食子酸和无水碳酸钠分别取2.5g/L所制造的生长环境完全符合空肠弯曲杆菌的生长需要,而PCR检测在检测准确性上要优于常规生化检测。2空肠弯曲杆菌在正常空气条件、37℃、pH为7、培养基为MHB时可以更快更好的形成生物膜结构,说明高温、微需氧以及高营养培养基并不适合构建空肠弯曲杆菌的生物膜模型。3在相同培养条件及时间的前提下,扫描电镜观察结果显示,在不锈钢针以及医用输液管上生物膜处于黏附期以及生长期,而在盖玻片上可以观察到成熟期的层叠状生物膜结构,这说明分离菌在三种载体上皆可以形成生物膜,但盖玻片是相对更适合的载体。42株分离菌对头孢哌酮为100%耐药,对喹诺酮类抗生素敏感,对阿奇霉素为高度敏感。空肠弯曲杆菌生物膜的抑菌浓度是浮游状态下该菌MIC值的几百倍至上千倍,但是却不能完全杀死生物膜内细菌,这说明临床使用的抗生素浓度很难治愈由空肠弯曲杆菌形成生物膜引发的疾病以及持续性感染。本研究在成功构建其生物膜模型的基础上,探讨不同环境因素对此菌生物膜形成的影响,了解和阐明空肠弯曲杆菌在外界的生存特性和致病特点,为预防和减少由于该菌引起的人畜共患病的发生和相关食品安全问题以及研究此菌生物膜及其耐药性等研究奠定基础,也可为其他细菌体外生物膜模型的构建提供一定的参考依据。
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