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目的:研究miR-322/503对模拟强直性肌营养不良1型(DM1)致病机制的成肌细胞分化抑制的逆转作用。方法:1、C2C12成肌细胞培养与分化,并进行成肌分化诱导.于0,1,2,4,6时间点进行样品收集。2、质粒构建与转染,构建GFP-CUG5和GFP-CUG200质粒,构建后利用脂质体转染入C2C12细胞中;构建pMSCV-Celf1 Flag-puro质粒,将Baylor医学院Tom Cooper提供pcDNA3-Celf1Flag质粒中含有Celf1 Flag的EcoRI片段插入pMSCV-puro质粒,pMSCV-miR322/503-puro质粒由美国休斯顿大学刘钰教授提供;将质粒用293T细胞包装制备逆转录病毒,随后转染C2C12细胞;3、抗体与免疫测定,western blot测定,按常规方法将转膜蛋白转移至硝酸纤维素膜上。先后用Celf1单克隆鼠抗、Flag、Actin一抗孵育及辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG二抗进行孵育,增强荧光试剂显色。4、实时定量RT-PCR,以GAPDH作为标准对照,测定MyoD(Myf3)、Myogenin(MyoG)、Mef2c、Celf1等基因在成肌分化中的变化。5、细胞染色量化与统计分析,核融合指数计算方法为肌管内总细胞核数(≥2 nuclei)占总细胞核数百分比。总肌管面积为图像被肌管覆盖区域所占百分比。每组分析至少涵盖1000个细胞核及至少3个随机选择区域,统计数据分析应用t检验评估两组差异性,P<0.05。结果:1、3?非翻译区的CUG扩增导致成肌细胞的分化损伤(1)α肌凝蛋白重链染色(MF20)可见GFP-CUG5组细胞肌管形成明显,相反,GFP-CUG200肌管形成数量很少;(2)肌管形成的定量分析表明CUG异常扩增造成肌管融合指数从(35.4±4.1)%下降到(2.6±1.1)%,肌管面积比例从(35.6±2.2)%下降到(2.7±0.8)%;(3)实时定量PCR分析显示,与CUG5培养组相比,CUG200增加了成肌细胞增殖过程中及分化早期Celf1 mRNA的表达,并且在分化过程中,CUG200抑制MyoD,MyoG and Mef2c表达;(4)Western blot结果显示CUG200组Celf1蛋白水平也相应地上升;2、过表达Celf1抑制成肌细胞的成肌分化(1)Western blot结果显示,Flag标签Celf1仅出现在pMSCV-Celf1 Flag转换细胞中,其Celf1蛋白表达水平上调;(2)MF20染色显示Celf1过表达组成肌细胞肌管数量减少;3、miR-322/503可逆转CTG三核苷酸重复片段异常扩增引所致的成肌细胞分化抑制(1)免疫荧光染色结果显示,在分化过程中,miR-322/503促进肌管形成;(2)融合指数和肌管面积分别为(26.6±5.5)%和(7.9±2.5)%,对照组分别为(6.4±1.0)%和(2.7±1.0)%;(3)实时定量PCR结果显示miR-322/503过表达细胞中MyoD,MyoG和Mef2C的表达显著增加,Celf1表达减少,支持挽救成肌细胞分化缺陷的结果;(4)western blot结果显示,相较对照组miR-322/503降低Celf1蛋白表达;4、miR-322/503可逆转RNA毒性所致的成肌细胞分化缺陷(1)MF20染色结果显示,miR-322/503过表达致使稳定表达GFP-CUG200的C2C12成肌分化增加。与少量多核肌管的对照组相比,表达miR-322/503的成肌细胞多核肌管显著;(2)核融合指数从(6.2±1.5)%增加至(36.1±2.1)%,相应地,肌管面积从(5.6±1.0)%增加至(16.2±1.5)%,但miR-322/503过表达的成肌细胞不能完全恢复至野生型细胞成肌分化程度;(3)实时定量PCR分析MyoD,MyoG和Mef2C也支持miR-322/503可挽救RNA毒性导致的成肌分化缺陷;(4)western blot结果显示,miR-322/503过表达组Celf1蛋白表达减少;结论:miR-322/503可逆转模拟DM1致病机制的成肌细胞分化抑制