海藻糖(Trehalose)是一种重要的非还原性二糖，广泛存在于生物体内。在海藻糖的工业生产中，酶催化法因其工艺简单、成本低、转化率高等优点，已经成为重要的生产方法。红色亚栖热菌(Meiothermus rubber)CBS-01海藻糖合酶(Trehalose synthase，M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应，且具有很好的热稳定性及pH耐受性，是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高M-TreS的酶学性能，使其能够满足工业生产的要求，有必要建立一种有效的定向进化方法对其进行改造。　　 海藻糖合酶M-TreS的基因全长2889bp，是一个相对较大的DNA分子。在几种常见的定向进化方法中，易错PCR能够随机的在该基因中引入点突变。而全长基因的DNA shuffling或者错列延伸法(the staggered extension process，StEP)法则不适于这种大分子的改造。为了加快M-TreS的进化速度，本实验将M-TreS的基因分成两个小片段进行改造，建立了分段DNA shuffling和分段StEP两种分段进化方法。分段进化的步骤大体为亲本分段、分段进化、完整基因突变群的组装及建立突变文库四个步骤。也就是说，分段定向进化巧妙的将大基因重组转变成小片段重组。实验表明，这种方法不但可操作性和可重复性都优于全长基因的shuffiing和StEP，而且能够加强M-TreS的进化强度。　　 本文建立了该酶的易错PCR、分段DNA shuffiing和分段StEP相结合的定向进化方法。几种方法的比较表明，易错PCR法产生的突变体中具有海藻糖合酶活性的突变体所占的比例较高，正向突变率高，但是变异的幅度较低，需要高灵敏度的筛选方法；分段DNA shuffling，致死突变率高，变异幅度较大，正向突变率较易错PCR低，比较适合目前的筛菌策略。而分段StEP，负向突变率较高，欲获得正向突变株需要构建较大的突变文库。所以，易错PCR与分段DNAshuffling的结合使用成为本文对M-TreS进化的主要策略，分段StEP可以作为辅助手段。　　 本文通过易错PCR和分段DNA shuffiing结合获得一株催化活性是野生型1.6倍，催化效率是野生型2倍的突变株。序列分析表明，该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代，其中一个来自易错突变，2个来自同源重组，其他三个为随机自发突变。