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目的:胃癌的形成、发展是一个缓慢、复杂的炎癌转变过程,一般沿着“慢性非萎缩性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃腺癌”方向发展,其中不完全肠上皮化生与异型增生因癌变风险较高,被称为胃癌前病变(gastric precancerous lesions,GPL)。自噬是细胞分解代谢过程,参与肿瘤的发生、发展,但其在GPL发病中所发挥的作用仍未明了。为明确自噬在GPL发病过程中所发挥的作用及中药复方胃痞灵对自噬的调控机制,研究基于PI3K/AKT/mTOR信号通路,分别运用生物信息学及网络药理学对GPL自噬、胃痞灵的作用机制进行分析,之后通过复制GPL小鼠模型,观察调控自噬对GPL的影响,继而明确胃痞灵对PI3K/AKT/mTOR信号通路所介导自噬的作用,从而揭示胃痞灵治疗GPL的作用机制,为临床运用此方提供依据。方法:1.生物信息及网络药理学研究(1)利用NCBI平台下的GEO数据库,检索GPL相关芯片数据,利用R语言Limma包对GPL差异基因进行分析,获取其中有关自噬的差异基因,分析差异基因的表达情况及差异基因所涉及的信号通路。(2)对胃痞灵中所包含的9味中药进行网络药理学分析,明确胃痞灵中所包含的活性成分及治疗GPL所涉及的靶点。之后对胃痞灵治疗GPL的作用靶点进行蛋白质互作网络分析、GO与KEGG富集,明确胃痞灵治疗GPL所涉及的机制,为后续实验验证提供依据。2.实验研究(1)GPL小鼠胃黏膜上皮细胞自噬活性及其调控机制首先应用浓度为120μg/mL MNU自由饮用,同时配合隔日禁食复制GPL小鼠模型,将48只小鼠随机分为空白对照组、模型组、自噬抑制剂3-MA组及自噬激活剂RAPA组,干预10周后处死小鼠后取材,HE染色观察小鼠胃黏膜病理学改变,PCR检测小鼠胃黏膜上皮细胞自噬基因ULK1、Atg7、Atg12、Atg16L1表达,Western blot检测自噬蛋白 LC3、p62、Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12 的表达。(2)胃痞灵调控PI3K/AKT/mTOR信号通路促GPL小鼠胃黏膜上皮细胞自噬采用上述方法复制GPL小鼠模型,将72只小鼠随机分为空白对照组、模型组、胃痞灵低剂量组、胃痞灵高剂量组、胃痞灵+3-MA组、RAPA组,之后对各组小鼠干预10周,通过HE染色及AB-PAS染色观察干预后各组小鼠胃黏膜病理,免疫组化观察Ki-67、Caspase-3表达,检测ALT、AST、肌酐、尿素氮以观察各组小鼠肝肾功能,PCR检测 ULK1、Atg12、Atg16L1、PIK3CA、AKT、mTOR 表达,Western blot 检测 LC3、p62、Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12及 PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、PTEN、p70S6k及4E-BP1蛋白的表达情况。结果:1.生物信息及网络药理学研究(1)对GSE55696数据中19例慢性胃炎病例与39例GPL患者表达谱基因芯片数据进行分析,获得9498个差异基因,涉及自噬的基因有77个。在77个自噬相关差异基因中,表达下调的基因有ULK1、ATG13、PIK3C3、ATG16L1、BAD等,而表达上调的有BCL2、TNF、HIF1A、IL6、S100A8等,差异基因主要涉及自噬、PI3K/AKT、凋亡等17条信号通路。(2)通过TCMSP数据库及中国科学院化学数据库,获得胃痞灵113个活性成分,利用TCMSP数据库、SymMap数据库与SwissTargetPrediction数据库检索113个活性成分所对应的靶点,共得到靶点107个,其中与GPL相关的靶点靶点49个。49个靶点涉及代谢相关生物学过程,与PI3K/AKT信号通路、TNF信号通路、凋亡等15条信号通路相关。2.实验研究(1)GPL小鼠组织病理学病变及调控自噬的干预效应与空白组比较,GPL模型组小鼠胃黏膜固有层厚薄不均,胃黏膜上皮腺体结构排列紊乱,腺腔边界欠清晰,出现相邻腺体背靠背、共壁改变,同时可见固有层出血;胃黏膜上皮细胞形态大小不一,可见细胞核深染、增大;LC3Ⅱ蛋白表达有显著性减少(P<0.05)、p62 蛋白表达均有显著性增加(P<0.05),ULK1、Atg7、Atg12、Atg16LlmRNA表达均有显著性减少(P<0.05),Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12蛋白表达均有显著性减少(P<0.05)。3-MA组胃黏膜腺体结构紊乱,腺管形状和大小不整,腺体拥挤、密集,细胞形态不—,细胞核深染、增大,呈现异型性;与模型组比较,LC3Ⅱ蛋白表达有显著性减少(P<0.05)、p62蛋白表达显著性增加(P<0.05),ULK1、Atg7、Atg12、Atg16LlmRNA 表达均有显著性减少(P<0.05),Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12蛋白表达均有显著性减少(P<0.05)。RAPA组小鼠腺体结构完整,边界清晰,固有层结构保存完好,未见细胞异型性及出血等改变;与模型组比较,LC3Ⅱ蛋白表达有显著性增加、p62蛋白表达有显著性减少(P<0.05);ULK1、Atg7、tg12、Atg16L1mRNA表达均有显著性增加(P<0.05);Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12蛋白表达均有显著性增加(P<0.05)。(2)胃痞灵通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路促GPL胃黏膜上皮细胞自噬各组小鼠经过10周的干预,HE染色结果显示胃痞灵高、低剂量组小鼠胃黏膜较模型组腺体排列相对整齐,腺体形态尚规则,基底侧可见细胞核深染,偶见细胞核增大、核质比增加;AB-PAS染色结果显示胃痞灵低、高剂量组主要以红染灶为主,部分蓝染。胃痞灵高、低剂量组Ki-67表达显著减少(P<0.05),Caspase-3表达显著增加(P<0.05);LC3Ⅱ蛋白表达显著增加、p62蛋白表达显著减少(P<0.05),ULK1、Atg12、Atg16LlmRNA 表达显著增加(P<0.05),Beclin-1、ULK1、Atg13、Atg5、Atg12蛋白表达显著增加(P<0.05)。胃痞灵高、低剂量干预后,PIK3CA、AKT及mTOR mRNA表达显著减少(P<0.05),PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p70S6k 及 4E-BP1 蛋白表达显著减少(P<0.05),PTEN蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论:1.GPL小鼠胃黏膜上皮存在自噬抑制,激活自噬可改善GPL小鼠病变。2.胃痞灵可通过激活PTEN,抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,激活自噬,从而逆转GPL小鼠胃黏膜病理学病变,阻断GPL恶性进展。