葡萄穗霉基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

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纤维素类物质和木聚糖是自然界中最廉价、最丰富的可再生资源,葡聚糖酶和木聚糖酶是降解它们最关键的酶类。为了利用丰富的纤维素资源和木聚糖资源,就必须获得性质优良的葡聚糖酶和木聚糖酶。真菌来源的糖苷水解酶61家族(GH61)和木聚糖酶是目前纤维素酶和半纤维素酶研究的主要部分。  本实验室已经对葡萄穗霉的全基因组进行了测序,并对部分基因进行了功能注释,为本实验奠定了基础。本实验首先从葡萄穗霉中挖掘可能的葡聚糖酶GH61家族和木聚糖酶的基因:gh2990、xya6205和xya4063,并根据其基因序列分别设计了引物,以葡萄穗霉基因组DNA为模板,通过PCR技术分别扩增到长度为1353bp、1699bp和753bp的片段,将片段克隆连接到穿梭载体pGAMDm上,结果表明,获得的片段为需要的目的基因。最后通过原生质体-PEG转化到黑曲霉G1上,SDS-PAGE结果显示,2种基因均能够重组表达,外源蛋白的分子量分别为48kDa和25kDa,与预期大小相符。将得到的目的转化子进行发酵培养后,测定了粗酶液的酶活及相关酶学性质。酶活测定结果显示,基因gh2990所表达的蛋白没有活性;基因xya6205所表达的蛋白XYA6205具有木聚糖酶活性,比活达392U/mg,其最适温度为50℃,最适pH为5.8,在pH5.2~8.2环境中处理18h后酶活较稳定,存在70%以上的残余酶活,pH6.8时最高,为85%。
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