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本文利用双向电泳技术对花生2s清蛋白的组成成分进行分析,由于2s清蛋白各组分的丰度不同,将蛋白按分子量大小分成三个组分,分别作为目的蛋白进行分离条件优化。条件优化主要在三个方面进行:在第一向方面,分别用不同长度和pI范围的预制胶条进行等点聚焦;在第二向方面,用不同浓度的的分离胶进行蛋白分离;另外一方面通过调整蛋白的上样量来优化分离效果。
得到的结论是:1.对于小分子量的蛋白组分(10~25KD),选择pI4~7,7 cm的线性预制胶条,一向等点聚焦20,000伏时,10%和16%夹层胶Tricine-SDS-PAGE的二向分离系统,此方法对小分子量蛋白组分的分离效果最好,分离出12.5% SDS-PAGE不能分离出的蛋白点。2.对于中间分子量的蛋白(25~50KD),选择pI5~8,24 cm线性预制胶条,一向等点聚焦90,000伏时,12.5% SDS-PAGE二向分离胶,蛋白上样量2.0 mg,分离效果最好。3.对于大分子量的蛋白(50~70KD),选择pI3~10,17 cm非线性预制胶条,一向等点聚焦65,000伏时,13.5% SDS-PAGE二向分离胶,蛋白上样量1.5 mg,得到较为理想的双向电泳图。
将凝胶上分子量17~23KD,等电点在pI5.6~5.9的6个成对排列的蛋白点命名为腹肌样(abdominal muscle like,AML)蛋白。通过和其他研究者的双向电泳结果的比较分析,证实AML蛋白在花生蛋白组中稳定存在,可作为判断双向电泳的重复性和稳定性的标志性蛋白点。
以肺腺癌A549细胞为作用对象,对2s蛋白中部分蛋白组分的功能进行研究。原核表达2s-5b蛋白,2s-5b蛋白是花生2s蛋白中的一个亚基,用其处理肺腺癌A549细胞,结果发现其对癌细胞的增殖没有抑制作用。
构建2s-4b蛋白的真核表达载体,转染肺腺癌A549细胞,应用光学倒置显微镜,苏木素-伊红染色进行用形态学观察,MTT法检测其对癌细胞的增殖的作用。结果显示其不能促进癌细胞凋亡,而抑制增殖作用不明显。