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目的： 套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)是起源于B细胞的非霍奇金淋巴瘤的一个特殊亚型，其侵袭性高，预后差，临床上难以治愈，尽管一些新的治疗手段如硼替佐米、利妥昔单抗等用于治疗套细胞淋巴瘤，但患者的总生存没有明显的提高，急需寻找新的治疗手段。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)以乙酰化修饰为作用靶点，使组蛋白和非组蛋白乙酰化，通过多种途径诱导肿瘤细胞的凋亡和分化，引起细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，并且与一些抗肿瘤药物联用具有协同作用。本实验通过研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米对人套细胞淋巴瘤细胞株Z-138细胞生长调控的影响，探索其作用机制，以期为临床治疗提供理论基础和实验数据，寻找套细胞淋巴瘤新的治疗手段。 方法： 1.细胞培养和传代 人套细胞淋巴瘤细胞株Z-138，培养于含体积分数10％的灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的改良型RPMI1640培养液中，置37℃、5％CO2的培养箱中培养，每48-72h传代一次，实验均采用对数生长期细胞，台盼蓝染色拒染率95％以上。 2.MTT法检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和/或蛋白酶体抑制剂硼替佐米对Z-138细胞生长的影响 2.1 SAHA抑制Z-138细胞增殖的实验 取对数生长期的Z-138细胞悬液，以2×105/ml的密度接种于96孔板，随机分为对照组和实验组(不同剂量SAHA组)。对照组加入100μl细胞培养液，实验组依次加入终浓度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00μMSAHA，置37℃、5％CO2的培养箱中培养，分别于加药后的24、48、72h向每孔中加入10μl5mg/ml的MTT溶液，继续于37℃、5％CO2的培养箱中孵育4h，然后离心培养板，小心吸去上清，向每孔中加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡器充分振荡，至结晶溶解后于酶标仪570nm处测量各孔的吸光度值。 2.2硼替佐米抑制Z-138细胞增殖的实验 取对数生长期的Z-138细胞悬液，以2×105/ml的密度接种于96孔板，随机分为对照组和实验组(不同剂量硼替佐米组)。对照组仅加细胞培养液，实验组依次加入终浓度为1、2、4、6、8、10 nM硼替佐米，同上述方法分别于加药后的24、48、72h测量各孔的吸光度值。 2.3 SAHA联合硼替佐米对Z-138细胞增殖的影响 取对数生长期的Z-138细胞悬液，以2×105/ml的密度接种于96孔板，随机分为对照组、SAHA组、硼替佐米组和SAHA＋硼替佐米组，分别于加药后的24、48、72h测量各孔的吸光度值，检测方法同上。 3.流式细胞术检测SAHA和/或硼替佐米作用于Z-138细胞后细胞周期和凋亡的变化 取对数生长期的Z-138细胞，以不同浓度SAHA和/或硼替佐米处理36h，收集细胞，4℃ PBS洗涤后，加入碘化丙碇(PI：50mg/ml，Triton-X1001.0％)500μl，4℃反应30分钟，用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡率。 4.流式细胞术检测不同浓度SAHA和/或硼替佐米处理Z-138细胞后NF-κB(p65)蛋白的表达情况 取对数生长期的Z-138细胞，加入不同剂量的SAHA和/或硼替佐米，培养24h后收集细胞，4℃预冷的PBS洗涤，加入NF-κB(p65)抗体，室温避光反应半个小时后加入二抗，应用流式细胞仪检测NF-κB(p65)蛋白的表达情况。 5.流式细胞术检测不同浓度SAHA和/或硼替佐米作用于Z-138细胞后bcl-2蛋白的表达情况 取对数生长期的Z-138细胞，加入不同剂量的SAHA和/或硼替佐米，培养24h后收集细胞，4℃PBS洗涤，加入bcl-2抗体，37℃水浴半个小时后加入二抗，应用流式细胞仪检测bcl-2蛋白的表达情况。 6.流式细胞术检测不同浓度的SAHA.处理Z-138细胞后细胞表面CD20的表达情况 取对数生长期的Z-138细胞，调整细胞密度为5×105/ml，每瓶接种3ml，随机分成对照组和实验组，对照组仅加入细胞培养液，实验组依次加入终浓度为0.005、0.010、0.100μM SAHA，培养24h后收集细胞，4℃ PBS洗涤，加入CD20抗体，避光反应1h后应用流式细胞仪检测CD20的表达情况。 结果： 1.SAHA抑制Z-138细胞的增殖，其效应在一定的浓度范围内呈时间-剂量依赖性。SAHA的浓度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00μM时，24h的细胞抑制率分别为(3.50±0.51)％、(9.95±0.99)％、(25.33±1.44)％、(38.43±1.74)％、(50.16±1.80)％；48h的细胞抑制率分别为(6.65±1.18)％、(16.65±1.45)％、(43.15±1.59)％、(62.97±2.38)％、(79.82±3.42)％；72h的细胞抑制率分别为(11.16±1.11)％、(28.64±2.74)％、(64.34±3.63)％、(83.24±4.30)％、(86.74±2.87)％，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 2.在一定的浓度范围内，硼替佐米抑制Z-138细胞增殖，其效应呈时间.剂量依赖性。硼替佐米的浓度为1、2、4、6、8、10nM时，24h的细胞抑制率依次为(3.52±0.65)％、(8.41±0.77)％、(18.61±1.44)％、(49.48±1.09)％、(66.33±2.00)％、(83.24±4.24)％；48h的细胞抑制率依次为(4.65±0.28)％、(11.24±0.39)％、(23.24±1.24)％、(58.71±3.36)％、(74.92±3.54)％、(87.73±1.65)％；72h的细胞抑制率依次为(6.73±0.62)％、(16.84±1.16)％、(31.31±0.53)％、(68.13±1.48)％、(82.63±1.72)％、(90.45±2.44)％，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。 3.SAHA和硼替佐米联用能协同抑制Z-138细胞的增殖。如：0.10μM SAHA、1nM硼替佐米、0.10gM SAHA＋1nM硼替佐米48h的细胞抑制率分别为(6.65±1.18)％、(4.65±0.28)％、(30.55±0.58)％；0.25gM SAHA、2nM硼替佐米、0.25gM SAHA＋2nM硼替佐米48h的细胞抑制率分别为(16.65±1.45)％、(11.244±0.39)％、(50.79±1.99)％。 4.SAHA单药或硼替佐米单药均可以诱导Z-138细胞凋亡，使细胞阻滞在G2/M期，其效应呈剂量依赖性。随着药物浓度的增加，凋亡率增加，处于G2/M期的细胞数增多。当SAHA和硼替佐米联用时，细胞凋亡率明显增加，同时更多的细胞被阻滞在G2/M期。对照组、0.25μMSAHA、2nM硼替佐米、0.25μM SAHA＋2nM硼替佐米处理Z-138细胞36h，凋亡率依次为(0.48±0.06)％、(2.25±0.21)％、(1.90±0.11)％、(23.79±1.46)％，差异具有统计学意义(P＜0.05)；对照组、1.00μMSAHA、10 nM硼替佐米、1.00μM SAHA＋10 nM硼替佐米处理Z-138细胞36h，G2/M期所占的比例分别为(9.07±0.86)％、(10.93±0.38)％、(16.47±1.06)％、(32.33±0.55)％，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 5.在一定的浓度范围内，SAHA单药或硼替佐米单药均可以下调细胞内NF-κB(p65)和bcl-2蛋白的表达，当两药联用时，NF-κB(p65)和bcl-2蛋白的表达明显下调。对照组、0.50μM SAHA、6nM硼替佐米、0.50μM SAHA＋6nM硼替佐米处理Z-138细胞24h，NF-κB(p65)蛋白的表达(均道值)依次为474.08±10.11、401.22±11.24、388.34±11.28和242.78±17.12，差异具有统计学意义(P＜0.01)。对照组、0.50μMSAHA、6nM硼替佐米、0.50μM SAHA＋6nM硼替佐米处理Z-138细胞24h，bcl-2蛋白的表达(均道值)依次为444.57±9.81、413.14±9.61、417.52±10.47、372.77±8.98，差异具有统计学意义(P＜0.01)。 6.小剂量SAHA可以上调细胞表面CD20的表达。对照组、0.005μMSAHA、0.010μM SAHA处理Z-138细胞24h，细胞表面CD20的表达(均道值)依次为498.14±6.32、517.70±5.98和559.49±5.21，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1.在一定的浓度范围内，SAHA可以抑制人套细胞淋巴瘤细胞株Z-138细胞的增殖，使细胞出现周期阻滞，其效应呈时间-剂量依赖性，其机制可能与下调NF-κB(p65)和bcl-2蛋白的表达有关。 2.在一定的浓度范围内，SAHA联合硼替佐米可以协同抑制人套细胞淋巴瘤细胞株Z-138细胞的增殖，其机制可能与协同下调NF-κB(p65)。和bcl-2蛋白的表达有关。 3.小剂量SAHA可以上调细胞表面CD20的表达，增加细胞对利妥昔单抗的敏感性，可能能够改善利妥昔单抗耐药，与利妥昔单抗联用可能具有协同作用，但有待于进一步的研究证实。