研究背景和目的原发性肝痛(hepatocellular carcinoma,HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率逐年增长,已超过62.6万／年,居于恶性肿瘤的第5位,死亡接近60万／年,位居肿瘤相关死亡的第3位。肝癌在我国高发,目前,我国发病人数约占全球的55%,在肿瘤相关死亡中位居第2位。因此,肝癌严重威胁我国人民健康和生命。肝痛治疗目前仍然以外科手术切除或肝移植为最佳选择,但大多数患者确诊时已是中晚期,而丧失手术机会,及肝痛对常见化疗药物不敏感,因此,目前没有有效的化疗方案用于肝癌的治疗。值得庆幸的是,分子靶向药物索拉菲尼是有史以来第一个能够使肝癌患者生存期延长的药物,给肝痛的治疗带来了新的希望。因此,有必要加强肝痛的基础研究,阐明其发病机制,发现和鉴定出高度特异性和敏感性的肿瘤分子标志物,用于肝癌的预后判断及研发新的分子靶向药物,进而提高肝癌患者的生存率和降低死亡率。FAT10也称为双泛素,是一种,由165个氨基酸组成的18KD的蛋白,在成熟B细胞和树突状细胞中表达,它属于泛素样调节子(UBL)蛋白家族,由两个泛素样部分前后融合而成。UBL蛋白家族通过与其他蛋白质共价结合而行使泛素样修饰作用。最近的研究表明UBL蛋白家族参与多种生物学过程,包括细胞分裂、DNA修复、自噬、信号转导及胚胎发育等。因此,UBL蛋白家族在许多人类疾病(尤其是肿瘤)的发生及发展中扮演了重要角色。研究发现FAT10在多种肿瘤中高表达,如肝痛、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等,与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。而其中FAT10与肝痛的关系最为密切。在肝癌发生研究中,经过如药物DDC (3,5-diethoxcarbonyl-1,4-dihydroeollidine)、灰黄霉素、狄氏剂等处理后的小鼠肝脏细胞中会出现Mallory Denk Bodies (MDBs),随后观察到这些小鼠肝脏发生了肿瘤,提示MDBs的形成是一种癌前病变。对这些用药物预处理后的小鼠肝脏进行基因表达谱分析,结果发现许多癌基因的表达上调,而其中表达上调最高的则是FAT10基因。进一步研究发现,FAT10表达阳性的肝细胞在停药后4个月中仍然持续过表达,停药8个月后在FAT10过表达的部分肝脏组织中发生了肿瘤,提示FAT10与肝痛的发生密切相关。然而,到目前为止很少有研究探讨FAT10在肝痛发生发展中的作用及其参与肝癌形成的具体机制。本文通过从基因和蛋白水平研究肝癌组织及癌旁组织中FAT10表达情况进而分析其对肝痛患者预后及术后复发的影响。进一步通过基因过表达及干扰手段探讨FAT10对肝癌细胞增殖、侵袭及上皮一间充质转化(EMT)等生物学过程的影响及其相关机制,阐明了FAT10在肝癌发生、发展中的作用,为判断肝癌预后及分子靶向治疗奠定了理论基础。方法1、FAT10在肝痛及癌旁组织中表达情况及临床意义利用Real-Time PCR方法检测30对肝癌组织及癌旁组织中FAT10mRNA的表达水平,同时利用western blot方法检测8对肝癌-癌旁配对组织中FAT10蛋白表达水平。进一步通过免疫组化方法检测FAT10在212例肝痛患者石蜡切片中的表达情况。为了证实上述实验结果,我们通过组织芯片技术进一步扩大样本量,检测278例肝癌、30例正常肝及50例肝炎肝硬化组织中FAT10表达水平。采用Mann-Whitney U-检验方法分析212例肝癌患者肿瘤切片中FAT10表达水平与相应临床病理参数的相关性。Kaplan-Meier法分析FAT10表达对患者总体生存率的影响。COX比例风险回归模型进行单因素及多因素分析影响肝痛患者总体生存率的危险因素。2、FAT10在肝痛细胞中的生物学作用用FuGENE(?) HD转染试剂介导pReceiver-M29-FAT10质粒转染HepG2及SMMC-7721肝癌细胞株,G418筛选阳性克隆；用阳离子脂质体LipofectamineTM RNAiMAX介导FAT10-siRNA转染Huh7及LM3肝癌细胞株,采用western blot方法鉴定转染后FAT10蛋白在细胞中的表达,然后利用MTT法测定转染前后细胞增殖能力的变化,BrdU掺入试验检测转染前后增殖期细胞数目变化,采用流式细胞仪检测转染前后细胞周期变化,western blot方法检测转染前后增殖及周期相关蛋白表达改变。进一步通过裸鼠皮下成瘤试验从体内验证FAT10过表达对肿瘤增殖活性的影响,利用免疫组化法检测FAT10过表达组与对照组裸鼠皮下瘤中增殖及周期相关蛋白表达情况。利用共聚焦显微镜观察肝痛细胞HepG2稳定表达FAT10前后细胞形态变化,通过western blot、免疫荧光及免疫组化等技术检测肝癌细胞株及皮下瘤组织在FAT10过表达或干扰前后发生上皮—间充质转化的相应蛋白定量及定位的改变。进一步利用transwell侵袭试验检测转染前后肝痛细胞株体外侵袭及迁移能力的改变。3、FAT10影响肝癌细胞增殖、侵袭及EMT的机制利用western blot法检测肝癌细胞株FAT10过表达和干扰前后Akt/GSK-3p通路中相关蛋白磷酸化与非磷酸化形式,通过使用PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002后观察以上蛋白磷酸化形式变化情况,同时采用MTT法检测通路抑制剂使用前后两组细胞体外增殖能力的改变。结果1、FAT10在肝癌组织中表达显著增高。Real-Time PCR方法检测30对肝癌组织及痛旁组织中FAT10mRNA的表达水平,同时利用western blot方法检测8对肝痛-痛旁配对组织中FAT10蛋白表达水平。结果表明不管是基因水平还是蛋白水平FAT10在肝痛组织中的表达都显著高于对应痛旁组织。进一步通过免疫组化方法检测FAT10在212例肝痛患者石蜡切片中的表达情况,结果显示212例肝癌标本中有126例(59.4%)检测到FAT10阳性表达。为了证实上述实验结果,我们通过组织芯片技术进一步扩大样本量,检测278例肝痛、30例正常肝及50例肝炎肝硬化组织中FAT10表达水平,结果显示278例肝痛标本中有191(68.7%)例检测到FAT10阳性表达,而正常肝组织及肝炎肝硬化组织中仅分别检测到4例(13.3%)和11例(22.0%)FAT10阳性表达(P<0.05)。以上结果充分表明FAT10在肝痛组织中表达显著增高。2、FAT10过表达与肝痛患者不良预后及术后复发密切相关。通过Mann-Whitney U-检验对212例肝痛患者石蜡切片中FAT10表达水平与相应临床病理参数的相关性分析,我们发现FAT10表达水平与肿瘤转移(P=0.039)及术后复发(P<0.001)密切关系。进一步我们探讨了FAT10表达与肝癌患者总体生存率的关系,结果表明FAT10高表达组较低表达组明显预后不良(n=212, P=0.001)。COX比例风险回顾模型进行单因素及多因素分析.显示FAT10表达可以作为预测肝痛患者不良预后的独立危险因素(P=0.015)。为了进一步观察FAT10表达与肝痛患者术后复发的关系。我们通过分层分析发现,FAT10高表达对肝癌复发组是一个不良预后指标(n=86,P=0.027),而对于无复发组患者却没有预后意义(n=126,P=0.107)。将复发与血清AFP水平联合作为分层因子,我们发现FAT10高表达对肝痛复发且血清AFP≧25ng/mL组是一个不良预后指标(n=67,P=0.003),而对于无复发且血清AFP<25ng/mL组患者却没有预后意义(n=42,P=0.820)。以上结果表明FAT10可以作为判断肝癌患者预后及预测肿痛术后复发的有效指标。3、FAT10诱导细胞周期进展促进肝痛细胞增殖活性。利用质粒转染及siRNA干扰技术,我们将肝痛细胞株进行FAT10过表达及基因敲除处理以探讨其生物学功能。运用MTT法检测细胞增殖能力,结果发现稳定表达FAT10后,肝痛细胞株HepG2及SMMC-7721的增殖能力明显增强(F=328.559,P<0.001；F=62.669,P<0.001)；而FAT10敲除后的Huh7细胞增殖能力显著下降(F=133.967,P<0.001)。将FAT10过表达的HepG2细胞与对照细胞分别接种到裸鼠皮下以观察皮下瘤增殖能力,结果表明FAT10过表达组裸鼠皮下瘤明显重于对照组裸鼠(P<0.05)。采用流式细胞仪检测转染前后细胞周期变化,结果表明,FAT10过表达后,HepG2细胞G0/G1期减少,S期增多,这一结果同样被BrdU掺入试验结果所证明,转染FAT10质粒后HepG2细胞S期细胞数目显著多于对照组细胞；相反,FAT10沉默后,Huh7细胞的Go/G1期增多,而S期减少,BrdU掺入试验同样支持这一结果。通过western blot试验检测增殖和周期相关蛋白,我们发现cyclin Dl,c-myc,CDK4和CDK6蛋白表达在FAT10过表达细胞株中显著上调,而在FAT10敲除后细胞株中显著下调。进一步对上述两组裸鼠皮下瘤组织进行免疫组化分析,同样发现增殖和周期相关蛋白PCNA,c-myc和cyclin Dl在FAT10过表达瘤组织中表达显著高于对照组。以上结果充分证明,FAT10通过诱导细胞周期进展从而促进肝癌细胞增殖活性。4、FAT10诱导上皮—间充质转化(EMT)增强肝癌细胞侵袭性通过共聚焦显微镜观察,我们发现FAT10稳定表达后的HepG2细胞形态发生了显著变化,细胞由正常培养条件下的多边或不规则上皮样细胞变成了梭形或细长形成纤维样细胞。这一形态学改变是细胞发生EMT改变的直接证据。在分子水平上,通过western blot检测,我们发现FAT10过表达后上皮marker E-cadherin显著下调,间质marker Vimentin显著上调。而当FAT10敲除后,我们得到了以上相反的结果。通过对E-cadherin蛋白上游调节分子snail1和smad2/3蛋白检测,我们发现FAT10过表达后snaill和smad2/3表达显著上调,而FAT10敲除后出现相反的改变。以上检测结果我们同样在裸鼠皮下瘤组织中得到再次验证,通过免疫组化分析,我们发现FAT10过表达组裸鼠皮下瘤组织vimentin和snail1染色增强,而E-cadherin染色却显著减弱。研究表明p-catenin在肝痛组织中表达显著增高,且是调节E-cadherin诱导EMT改变的重要分子,同时,其定位发生胞浆—胞核转位后可以通过启动下游靶基因从而诱导包括增殖、侵袭及EMT在内的许多生物学过程。通过western blot及免疫荧光试验对β-catenin进行定量及定位分析,我们发现FAT10过表达后β-catenin表达显著上调,且从胞浆向胞核转位,而FAT10敲除后其表达下调,细胞内定位由胞核转向胞浆。同样在裸鼠皮下瘤组织中通过免疫组化染色我们观察到FAT10过表达组瘤组织β-catenin染色较对照组显著增强,且个别肿瘤细胞出现胞核定位。以上结果表明FAT10过表达不仅可以在体外诱导肝癌细胞发生EMT改变,而且可以在体内诱导肿瘤组织发生EMT改变。研究表明细胞发生EMT改变将显著增强其侵袭及迁移能力。我们通过transwell侵袭实验证明了上述理论,实验结果表明FAT10过表达后肝痛细胞株HepG2侵袭及迁移能力显著增强(P<0.001)；而FAT10敲除后肝癌细胞株Huh7侵袭及迁移能力显著减弱(P<0.001)。上述结果充分表明FAT10通过诱导EMT改变从而增强肝癌细胞侵袭性5、FAT10激活Akt/GSK-3p信号通路基于上述研究结果,我们进一步探讨了FAT10调节肝癌细胞增殖、侵袭及EMT的分了机制。通过western blot试验,我们发现FAT10过表达后肝痛细胞中磷酸化Akt表达显著升高,FAT10敲除后肝痛细胞中磷酸化Akt表达显著降低,而两组细胞中总的Akt表达水平却基本不变。我们进一步检测了PI3K/Akt下游的调节分子GSK-3β,结果表明其磷酸化蛋白(失活形式)在FAT10过表达肝痛细胞中显著上调,而在FAT10敲除后肝痛细胞中表达降低。这一结果也同时符合之前的研究,即失活状态下的GSK-3p可以上调snail和β-catenin,进而潜在调节肝癌细胞增殖、侵袭及EMT等生物学过程。为了进一步证实上述实验结果,我们应用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002阻断上述通路后,通过western blot再次检测p-Akt、p-GSK-3β及β-catenin蛋白表达水平,我们发现使用通路抑制剂LY294002后FAT10过表达肝痛细胞HepG2及SMMC-7721中上述蛋白均显著下调。MTT体外增殖试验也证明使用LY294002处理后肝癌细胞不同分组增殖能力均显著下降(F=68.068,P<0.001;F=2165.000,P<0.001)。以上实验结果充分证明FAT10主要通过激活Akt/GSK-3β信号通路从而调节肝癌细胞增殖、侵袭及EMT过程。结论1、FAT10在肝癌组织中表达显著增高,可以作为判断肝痛患者预后及预测术后复发的有效指标。2、FAT10诱导细胞周期进展促进肝痛细胞增殖活性。3、FAT10诱导EMT改变增强肝癌细胞侵袭性。4、FAT10通过激活Akt/GSK-3β信号通路从而调节肝癌细胞生物学功能。