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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年期的中枢神经系统(central nervous systerm,CNS)退变性疾病,其主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元进行性死亡,导致纹状体多巴胺(Dopamine,DA)含量下降。患者典型的临床症状为震颤、肌僵直和运动迟缓等。随着社会老龄化的进程,PD的发病率逐年上升,已经成为严重的社会问题。
PD的病因和发病机制目前尚不清楚,最近研究表明中枢免疫功能异常与PD发病密切相关。中枢免疫异常主要表现为小胶质细胞过度活化,分泌大量细胞毒性物质,如一氧化氮,促炎因子,兴奋性氨基酸,活性氧自由基,花生四烯酸及其代谢产物等。这些细胞毒性物质均参与了DA能神经元的退变过程,而抑制小胶质细胞激活的药物具有神经保护作用。远志皂苷(tetluigenin,TEN)是中药远志中提取的活性成份,近期研究表明,远志皂苷具有抗痴呆、抗衰老、抗炎、抗氧化等多种生物活性。为了探讨TEN是否对DA能神经元具有保护作用,其抗炎活性是否参与了神经保护作用,本研究通过建立细菌细胞壁脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的PD炎症模型,从整体角度初步观察和分析了远志皂苷对DA能神经元的保护作用及机制。
结果:
采用脑立体定位手术向大鼠右侧黑质内注射10μgLPS,建立炎症PD大鼠模型。用不同剂量TEN(200mg/kg/d和300mg/kg/d)灌胃给药14w,观察其对PD模型大鼠行为学、纹状体DA含量、黑质DA能神经元数量、黑质小胶质细胞的激活状态和促炎因子TNF-α、IL-1β含量的影响。
1.在11周的转杆实验中发现TEN(200mg/kg和300mg/kg)可明显减少PD模型大鼠因损伤导致的在转杆上停留时间的差异,分别达模型组的32%和42%;在历时30分钟的矿场实验中,发现TEN(200mg/kg和300mg/kg)可以延长或增强PD模型大鼠的活动总距离、水平活动次数、活动时间及刻板计数情况,分别达模型组的277%和260%、198%和178%、231%和211%、183%和154%,但休息时间较模型组缩短,分别达模型组的88%和90%,以上差异均具有显著性,表明TEN可明显改善PD模型大鼠的异常行为;
2.高效液相--电化学检测法(high performance liquid chromatography-electrochemical detection,HPLC-ECD)检测纹状体DA及其代谢物含量,发现TEN(200mg/kg和300mg/kg)可阻止损伤侧纹状体DA含量的降低,分别达模型组的202%和225%,DA的代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxy phenylacetic acid,DOPAC)的含量也高于模型组,分别达模型组的168%和179%,以上差异均具有显著性,表明TEN对DA能神经元具有一定的保护作用;
3.用酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫组化染色方法观察了黑质DA能神经元的数目,结果显示,TEN(300mg/kg)处理组DA能神经元数目明显高于模型组,达模型组的203%,且该差异具有显著性,表明TEN从数量上对DA能神经元具有一定的保护作用;
4.用小胶质细胞表面特异性标志物CD11b免疫组化染色方法观察了黑质小胶质细胞的活化状态,结果显示:模型组损伤侧的小胶质细胞表面的CD11b表达明显上调,小胶质细胞体积增大,分支增多变粗。经TEN灌胃处理后,损伤侧黑质小胶质细胞CD11b蛋白含量明显降低,胞体体积较小,分支减少,较模型组有明显改善,表明TEN处理可明显抑制LPS诱导的小胶质细胞活化;
5.用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA)法检测了黑质促炎因子TNF-α和IL-1β的含量,结果显示,LPS可诱导这两种促炎因子表达,TEN处理组(200mg/kg和300mg/kg)两种细胞因子的含量均明显低于模型组,其中TNF-α的含量分别降低38%和31%,IL-1β的含量分别降低50.5%和64.4%,表明TEN有效地抑制了黑质中LPS诱导的促炎因子的释放。
结论:
1.首次在整体炎症PD模型中证实了远志皂苷具有明确的神经保护作用;
2.整体实验证明TEN的抗炎活性参与了其神经保护作用,作用机制可能是抑制小胶质细胞异常活化和细胞毒性物质的分泌;
3.本研究显示我国的传统中药远志皂苷对LPS诱导的炎症PD模型大鼠DA能神经元具有明确的保护作用,沿这一方向继续进行深入全面的研究,可能会开发出有效的神经保护药物,为药物防治PD等神经退行性疾病提供新的思路。