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阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease)简称AD,是一种逐渐进展的神经系统退行性疾病,是老年痴呆最常见的类型,占所有痴呆病例的50%到75%。临床上主要以记忆障碍、失语、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆特征。由于起病缓慢或隐匿,至今还未发现有效的治疗措施。据统计,2015年全球痴呆患者人数已达4680万人,其中50%-75%为阿尔茨海默病患者。目前,中国阿尔茨海默病患者人数已居世界第一。而全球痴呆患者每20年增加一倍,预计到2050年将达到1.31亿人。目前,老年痴呆已经成为老龄化社会主要致死和致残的疾病之一,给家庭和社会带来了沉重的负担。众多研究发现,老年痴呆患者中,女性多于男性,呈3:1的发病几率并且多见于绝经后的女性。因此,老化导致的卵巢雌激素下降被认为是老年痴呆患病的主要原因之一。脑内雌激素有两条来源途径,一是源于卵巢的循环雌激素,另外一条是脑内的雄激素经芳香化酶催化转化而来的雌激素即脑源性雌激素。海马是脑内的重要结构,与学习记忆与认知密切相关。大量文献证实循环雌激素具有强大的神经保护作用,而且雌激素能够明显改善认知记忆,因此雌激素替代已经用于临床试验,但其有无疗效与副作用尚不明确,其调节海马突触可塑性的机制尚不清楚。前人和课题组既往研究均证实海马有较高水平的芳香化酶表达,且海马源性雌激素对海马的结构和功能也具有重要的调节作用,然而其具体调节机制同样不清楚。突触可塑性包括突触形态的可塑性(突触形态、密度以及树突棘密度等)是学习记忆的基础。研究发现卵巢切除能导致海马突触密度和树突棘密度显著下降且雌激素替代可逆转上述现象,表明卵巢雌激素可调节神经元细胞骨架。我们近期工作发现用芳香化酶抑制剂来曲唑处理能抑制海马CA1突触密度以及突触后膜厚度显著下降,提示海马源性雌激素也参与了对细胞骨架重塑的调节。然而,两种来源的雌激素是如何调节海马神经元细胞骨架?对此问题目前尚未见文献报道。众所周知,actin是最重要的细胞骨架蛋白之一,对细胞形态的可塑性与维持极为重要。单体球状肌动蛋(globular actin,G-actin)与聚合态的纤维肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)的动态变化是突触可塑性的基础。研究发现Profilin和Jasplakinolide(海绵Jaspis johnstoni的大环肽天然产物,JPK)可以促进G-actin聚合为F-actin,而cofilin和细胞松弛素D(Cytochalasin D,Cyto D)则可以促进F-actin解聚为G-actin。Rictor(rapamycin-insensitive companion of m TOR)是不依赖雷帕霉素的雷帕霉素哺乳动物靶蛋白复合体2(mammalian target of rapamycin complex 2,m TORC2)的核心成分。研究发现Rictor对actin细胞骨架的动态变化具有重要的调节作用,其通过磷酸化AKT促进actin的聚合是短时记忆能够得以巩固并转变为长时记忆的关键。已有研究经发现雌激素在外周组织中以及海马神经元中均可以调节细胞骨架的聚合,然而其具体机制尚不明确。雌激素可以通过两条途径发挥其作用。经典的作用方式为雌激素与其核受体(ERα和ERβ)结合发挥其调控基因转录的效应,另外一种是雌激素与其膜受体结合发挥其快速的非基因调控效应。GPR30(G Protein-coupled Receptor 30)或GPER(G Protein-coupled Estrogen Receptor)属于G蛋白偶联受体家族,是近年来新发现的雌激素膜受体,雌激素与其结合之后能够启动胞外第二信使途径发挥快速的调节作用。研究发现,雌激素膜受体GPR30广泛表达于海马并且能够调节突触蛋白的表达进而在学习记忆中发挥作用,但其是否介导了雌激素对海马神经元actin细胞骨架的调节以及具体的调节机制目前还不清楚。为了探究GPR30调节海马神经元actin细胞骨架的具体机制,在本课题我们进行了以下实验研究:1.用免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)和免疫印迹(Western blot,WB)检测了生后到成年时期以及卵巢切除和来曲唑处理后海马GPR30以及actin细胞骨架聚合蛋白Profilin-1的表达变化;2.采用卵巢切除(OVX)、OVX+GPR30激动剂G1以及GPR30拮抗剂G15等方法处理小鼠,然后用Morris水迷宫方法检测了动物学习记忆行为的变化、用高尔基镀银染色法检测了海马树突棘密度的变化;用WB检测了海马雌激素核受体及其辅助活化因子SRC-1、Rictor及其下游效应分子AKT、actin细胞骨架聚合调节蛋白Profilin-1和cofilin、重要突触蛋白PSD95与Glu R1等分子表达的变化以及F-actin/G-actin比例的变化。3.利用m Hippo E-14海马神经元细胞株,单独或联合应用G1、G15、SRC-1特异性抑制剂蟾毒灵(Bufalin,Bu)、PI3K抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin,WM)、JPK和Cyto D处理,然后检测actin细胞骨架聚合调节蛋白以及突触蛋白的表达变化。主要实验结果:1.GPR30在生后(P0-P56)小鼠海马的表达随发育水平呈逐渐递增的趋势。其中,P0的表达量最低,P56的表达量最高。OVX和LET处理一周均能显著下调海马GPR30的表达。Profilin-1的变化与此类似。此外,OVX和LET能显著下调actin聚合蛋白Profilin-1的表达并显著抑制actin的聚合(F-actin/G-actin比例显著下降)。2.OVX能诱导小鼠明显的学习记忆下降,显著下调树突棘密度、雌激素核受体以及SRC-1、突触蛋白、Rictor、细胞骨架聚合调节蛋白的表达以及F-actin/G-actin的比值。GPR30激动剂G1能逆转OVX所致的学习记忆行为下降以及上述分子表达的下降。GPR30抑制剂G15则能模拟OVX的上述效应。3.离体实验中,G1能显著上调细胞骨架聚合蛋白、Rictor、SRC-1和突触蛋白的表达,而G15能明显抑制上述分子的表达;SRC-1抑制剂蟾毒灵Bu与G1联合处理能拮抗G1的激动效应,WM与G1联合处理后G1的激动效应也被拮抗;JPK对细胞骨架聚合和突触蛋白表达的促进效应能够被G15所抑制,而G1对actin聚合以及突触蛋白表达的促进作用能被Cyto D所阻断。主要结论:1.从生后到成年,海马GPR30和actin聚合蛋白Profilin-1的表达随发育水平呈逐渐递增且均受卵巢雌激素和海马源性雌激素的调节,提示GPR30可能参与了雌激素对海马actin细胞骨架的调节。2.卵巢去势显著抑制细胞骨架聚合并导致树突棘密度的下降以及学习记忆下降,G1和G15分别能逆转或模拟卵巢去势所导致的上述效应,证实GPR30在雌激素调节海马学习记忆和海马突触可塑性过程中发挥了重要作用。3.GPR30可能是通过SRC-1介导的核受体途径和/或PI3K两条途径作用于Rictor(m TORC2)通路、影响其下游的骨架蛋白表达变化、进而影响细胞骨架的重塑并最终影响学习记忆。