戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是无包膜的单股正链RNA病毒，主要通过胃肠道传播，是引起急性戊型肝炎(Hepatitis E，HE)的病原体。目前HE尚无特异有效的抗病毒治疗药物，因此，HEV疫苗在有效控制HE中的作用受到人们的重视，被WHO列为21世纪优先发展的疫苗之一。 要成功研制预防用 HEV疫苗，关键在于该疫苗能否诱导出具有保护作用的中和抗体，因为灵长类动物实验已多次证实体液免疫应答在阻断 HEV的感染中发挥了重要的作用。而中和抗体的产生必须基于HEV中和抗原表位对机体免疫系统的刺激。我们在先前的研究中，利用抗原mapping技术和基于PCR的体外中和试验在国内外首次发现HEV中和抗原表位是一种构型依赖性表位，位于HEV ORF2编码蛋白的第452至617位氨基酸之间。研究结果为研制基于中和表位的HEV疫苗奠定了物质基础。但是，由于 HEV细胞培养十分困难，难以研制传统的灭活疫苗和减毒活疫苗，目前的HEV候选疫苗主要是通过基因工程技术制备的重组蛋白。而基因疫苗因其具有制备简单、性质稳定、可天然地表达抗原蛋白、同时诱导特异性体液和细胞免疫应答等优点也倍受人们关注，并已开始用于HEV疫苗的研究。 在本研究中，我们以美国FDA首次批准能用于人体试验的真核表达载体pWAX1构建含HEV中和抗原表位的HEV-ORF2<'439～617>(p179)为靶基因的重组质粒，以肌肉注射法进行基因免疫，观察该基因疫苗在小鼠体内诱导HEV特异性体液免疫应答的效果；在此基础上，在p179编码基因的5'端插入通用信号肽(tPA)编码序列，探讨真核表达载体产生的分泌性靶抗原能否增强基因免疫诱导的特异性抗体水平。同时，引入分子佐剂C3d，探讨C3d对基于HEV中和表位-p179基因疫苗诱导的免疫应答的调节作用。 方法： 将HEV-p179、HEV-tPA-p179和3拷贝的C3d编码基因分别插入真核表达载体pVAX1，构建重组质粒pVAX-179、pVAX-tPA-179、pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3。米用脂质体转染法分别将上述四种重组质粒体外转染HEK-293T细胞和7721人肝癌细胞，并以 Western blot法和间接免疫荧光法检测靶抗原的表达；RT-PCR法检测pVAX-179-C3d3质粒转染的真核细胞中p179和p179-C3d3融合蛋白在mRNA水平的表达；pVAX-179和pVAX-179-C3d3转染HEK-293T细胞后收集细胞裂解液上清、分别与CR2<'+>Raji细胞孵育，通过间接免疫荧光法检测p179-C3d3融合蛋白体外结合C3d受体(CR2)的功能；采用肌肉注射法分别于0、2、4周对BALB/c小鼠分组实施基因免疫(100μg/100μl/只小鼠，每组8只小鼠)，设pVAXl组为对照；定期采集血清标本，ELISA法检测各组小鼠血清中抗HEV-p179 IgG及其亚类，并以硫氰酸盐洗脱法检测血清特异性IgG抗体的亲合力；分离免疫小鼠第12周脾细胞，经体外特异性抗原p179蛋白刺激72h后，采用ELISA法检测培养上清的细胞因子。 结果： 1. 酶切实验及DNA序列分析证实：成功构建了基于中和抗原表位-p179的真核表达质粒： pVAX-179、pVAX- tPA-179、pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3。间接免疫荧光及Western blot检测显示：与空质粒pVAX1作对比，pVAX-179、pVAX-tPA-179、 pVAX-179-C3d3均能在体外真核细胞中有效地表达目的抗原-p179。RT-PCR检测目的基因的mRNA，结果显示在pVAX-179-C3d3质粒转染细胞中，不仅可以检测到p179 mRNA、而且能检测出p179-C3d3融合蛋白的mRNA。设计间接免疫荧光法检测 p179-c3d3融合蛋白的功能，发现p179-C3d3融合蛋白具有与C3d受体-CR2特异性结合的能力。这些结果提示在目的抗原基因5'端插入信号肽(tPA)编码基因以及3 '端连接3拷贝的C3d编码基因均不影响p179抗原的表达及其抗原性；p179-C3d3融合蛋白不影响其中C3d分子与其受体CR2特异性结合的功能。 2. 检测pVAX-179质粒免疫小鼠后诱导的血清特异性抗HEV IgG抗体，发现小鼠于第4周开始产生抗体，第8周达到高峰，抗体的亲和力略高于p179蛋白免疫(第10周的 ED<,50>2.5 vs 2.0)，IgG亚类以IgG2a为主，中和实验的结果提示pVAX-179基因免疫诱导的抗体具有体外中和病毒的作用，中和效价为1：1。 3. 比较pVAX-179和pVAX-tPA-179免疫小鼠血清的特异性IgG抗体水平，发现 pVAX-tPA-179基因免疫组比pVAX-179基因免疫组提前1-2周产生特异性抗HEV抗体、而且抗体水平高于pVAX-179组；抗体亚类检测结果显示pVAX-tPA-179诱导的抗体亚类以IgG2a为主，但更加显著地提高了IgGl的水平。提示引入通用信号肽而产生分泌性的p179增强了基因疫苗诱导的抗体水平，并促进基因疫苗向体液免疫方向发展。亲合力检测的结果显示pVAX-tPA-179免疫小鼠诱导的抗HEV抗体的亲合力与 pVAX-179组小鼠的亲合力相比没有显著差别(第8周的ED<,50>：2.5 vs 2.3)，中和实验的结果显示抗体的中和效价仍为1：1。 4. 分别在p179和tPA-179融合蛋白的C端引入3拷贝的C3d分子，以探讨分子佐剂C3d对基于中和表位-p179的基因免疫的增强作用。检测重组质粒pVAX-179、pVAX-tPA-179、 pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3免疫小鼠的血清特异性IgG及IgG亚类，结果发现：pVAX-179-C3d3免疫组诱导的特异性抗HEV IgG水平显著高于pVAX-179重组质粒免疫组(p<0.01)，pVAX-tPA-179-C3d3重组质粒免疫组诱导的特异性抗HEV IgG水平不仅显著高于pVAX-179重组质粒免疫组(p<0.001)而且显著高于pVAX-tPA-179免疫组(p<0.05)。检测小鼠血清第六周和第八周的抗体亲和力发现pVAX-tPA-179-C3d3质粒免疫诱导的抗体亲合力水平(ED<,50>由第6周的2.3上升到了第8周的3.2)明显高于 pVAX-179组(第8周的ED<,50>为2.3)SNpVAX-tPA-179组(第8周的ED<,50>为2.5)。中和实验的结果显示抗体的中和效价达到了1：16。提示分子佐剂C3d能增强HEV基因免疫的体液免疫应答。探讨C3d增强HEV体液免疫应答的机理发现分别与pVAX-179和pVAX- tPA-179重组质粒免疫组相比，pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3基因免疫虽然没有改变特异性IgG亚类的格局一仍以IgG2a为主，但IgG1亚类抗体水平提高显著，诱导了小鼠免疫应答往体液免疫应答的方向发展；ELISA法检测免疫小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IL-4的水平，发现pVAX-179-C3d3组和pVAX-tPA-179-C3d3组小鼠脾细胞在p179蛋白的剌激下，分泌的IL-4水平均高于-pVAX-179组，这进一步证实了C3d具有增强小鼠体液免疫应答的作用。 结论： 1．成功构建了基于戊型肝炎病毒中和表位p179的真核表达载体：pVAX-179、pVAX-tPA-179、pVAX-179-C3d3和pVAX—tPA-179-C3d3； 2．基于戊型肝炎病毒中和表位p179基因疫苗在小鼠体内成功诱导了抗HEV-IgG抗体应答，并且抗体具有中和作用。 3．靶抗原基因N端引入通用信号肽序列(tPA)能增强分泌性抗原蛋白的表达，能增强基因免疫诱导的抗原特异性体液免疫应答。 4．引入C3d作为基因免疫的分子佐剂能够进一步增强基于戊型肝炎中和表位的特异性体液免疫应答。