目的: 卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤，其死亡率居妇科恶性肿瘤首位，目前已成为严重威胁妇女生命和健康的主要肿瘤，其主要特征是肿瘤细胞的恶性生长、转移、复发及化疗耐药，病因和发病机制尚不清楚，最近研究认为，肿瘤中存在一小群具有自我更新和分化潜能的细胞，即肿瘤干细胞，这种细胞具有干细胞特性，例如非锚着性生长，自我更新和无限增殖，多向分化潜能和天然耐药性，对化疗药物易产生抵抗作用，它们可能是肿瘤转移和复发的根源。目前为止，研究人员已经在白血病、乳腺癌以及中枢神经系统肿瘤中分离并鉴定出了肿瘤干细胞，另外，在肺癌、前列腺癌和卵巢癌中也发现了肿瘤干细胞，由于干细胞在体外很难分离纯化，长期传代，所以为临床治疗带来困难，我们的前期实验已经从卵巢癌细胞系中成功分离出卵巢癌类干细胞，在此基础上，我们探讨卵巢癌类干细胞冻存复苏的条件及保存传代的方法，通过计数细胞数的方法绘制细胞生长曲线、计算分裂指数，了解卵巢癌类干细胞的生长特性，为进一步从肿瘤干细胞方面研究肿瘤的耐药机制提供可信的理论依据，从而为临床上卵巢癌的治疗提供更多的可行性。 材料与方法: 一、材料 1、细胞系 卵巢癌细胞系OVCAR3由中国医科大学附属盛京医院妇产科周欣老师惠赠。 2、主要试剂 DMEM/F12培养基(Invitrogen)、B27添加剂(Gibco)、EGF(Peprotech)、bFGF(Peprotech)、肝素(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、胰酶抑制剂(Gibco)、超低吸附的6孔细胞培养板(Coming)、甘油(Glycerol Biosharp Amresco)、Giemsa染液(沈阳试剂三厂)、FBS(天津颢洋生物制品科技有限责任公司) 3、主要仪器 CO2孵箱(RS biotech galaxyS)、超净工作台(ESCO biotech sve—4A1)、倒置相差显微镜(OLYPUS) 二、方法 采用无血清悬浮培养的方法提取卵巢癌类干细胞并进行冻存和复苏，细胞计数法绘制生长曲线、计算分裂指数。 实验结果: 1、细胞培养的形态学观察 将贴壁细胞消化后，通过无血清培养可获得具有非锚着性悬浮生长的细胞球，其在超低吸附培养板中和琼脂铺板的培养皿中细胞球形态基本相同(前期的实验结果已经初步证实我们获得的细胞球富集卵巢癌类干细胞，具有自我更新、无限增值的能力)。 2、卵巢癌类干细胞的传代培养 从贴壁细胞中提取出卵巢癌类干细胞后可以连续传代达14代以上。 3、细胞冻存复苏实验 用两种冻存液冻存的细胞经复苏后生长状态均良好，传代一次后计算增殖情况无明显差别。 4、生长曲线 细胞在最初3天内生长速度较缓慢，曲线基本成平线状，第4天开始出现对数期生长；悬浮细胞的生长速度较贴壁细胞缓慢。 5、分裂指数 贴壁细胞在72小时前分裂指数呈上升趋势，72小时达到峰值，而后分裂指数逐渐下降。 结论: 1、将贴壁细胞消化后，通过无血清培养可获得具有非锚着性悬浮生长的细胞球，其可在无血清条件下连续传代十数代以上，并保持非锚着性悬浮生长的特性。 2、以冻存液2：DMEM/F12(4ml，其成分同卵巢癌类干细胞培养液)+8％DMSO(400μl)来冻存细胞结果最为简单合适。 3、人卵巢癌类干细胞的生长曲线比传代培养细胞更平缓，发展趋势更缓慢，这与干细胞处于慢周期的生物学特性相一致。