第一部分基因芯片及生物统计学方法预测与药物敏感性相关的microRNA研究目的：应用基因芯片技术及生物统计信息学软件,利用PCb(紫杉醇+卡铂)方案新辅助化疗达到pCR患者与未达到pCR患者的化疗前空芯针活检肿瘤组织,寻找与乳腺癌PCb方案新辅助化疗疗效相关的microRNA。研究方法：以6例接受PCb方案新辅助化疗获得病理完全缓解(pCR)的乳腺癌患者和25例未获得病理完全缓解(non-pCR)的乳腺癌患者为材料,应用人类全基因组表达谱芯片(Affymetrix, U133Plus2.0)进行全基因组表达谱分析,利用Significance Analysis of Microarrays (SAM)方法筛选不同疗效患者之间的差异表达基因(DEGs),运用层次聚类(Hierachical Clustering Analysis)行聚类分析并对全组病例行预测分析；并利用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术在独立验证样本组中进行验证。采用CORNA生物统计学软件预测参与调控差异表达基因的上游microRNA。进一步利用qRT-PCR技术分析独立验证样本(25例接受PCb方案新辅助化疗获得pCR的乳腺癌患者与25例non-PCR乳腺癌患者)的miR-345/621表达水平。研究结果：全基因组表达谱芯片结果显示,接受PCb方案新辅助化疗疗效评价不同的乳腺癌患者之间的全基因组表达谱存在显著差异,初筛出了231个差异表达基因(DEGs),用层次聚类分析方法能较准确区分pCR组与non-pCR组的差异表达基因。运用qRT-PCR技术(以GAPDH基因为内参照)在独立验证样本组中对部分DEGs进行了验证,得到与芯片分析相对一致的结果。运用CORNA软件预测差异表达基因上游调控的microRNA,结果提示miR-345、miR-621可能参与其中某些差异表达基因的调控,进而影响肿瘤治疗的药物敏感性。继而在独立验证样本组中应用qRT-PCR技术(以U6基因为内参照)分析pCR患者与non-pCR患者miR-345、miR-621的表达差异,发现miR-621的表达在两组患者之间有显著差异(P<0.05),获得pCR患者组的miR-621表达水平相较non-pCR组患者有显著上调。研究结论：全基因表达谱芯片能较准确区分化疗pCR与non-pCR之间的基因差异,基因芯片技术在探索新辅助化疗疗效预测因子上有较高应用价值。miR-345、miR-621可能参与调节乳腺癌对紫杉醇PTX及卡铂CBP治疗的敏感性。第二部分miR-345/621调控药物敏感性的研究及miR-621靶基因的筛选研究目的：进一步研究预测得到的miRNA-345/621及下游调节靶基因在乳腺癌PCb方案新辅助化疗疗效预测中的作用,探讨miR-345/621调控药物敏感性的可能机制。研究方法：选用常见人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-231HM细胞,利用qRT-PCR技术检测乳腺癌细胞加入紫杉醇(PTX)、卡铂(CBP)药物作用后miR-345/621的表达水平变化,进一步验证预测得到的miRNA在药物敏感性调控中的作用。并通过调控miR-345/621的表达水平,利用CCK-8药敏实验观察不同表达水平的miR-345/621对乳腺癌细胞化疗药物敏感性的影响。进一步运用miRNA靶基因预测软件TargetScan与miRanda对miR-621的靶基因进行生物信息学预测。根据前期分析得到的差异表达基因及软件预测筛选miR-621的候选靶基因,运用qRT-PCR和Western Blot技术验证候选靶基因在miR-621表达水平不同的乳腺癌细胞系中的表达情况。研究结果：随着药物作用浓度的升高,乳腺癌细胞miR-621的表达水平逐渐下降,即miR-621表达水平的下调可降低乳腺癌细胞药物敏感性。通过转染pre-miR-621来上调miR-621的表达水平,应用CCK-8方法检测细胞对紫杉醇(PTX)及卡铂(CBP)的药物敏感性(IC50半数抑制浓度),发现miR-621表达水平的上调可显著增加上述细胞对PTX及CBP的药物敏感性。而转染pre-miR-345来上调miR-345的表达水平,也可增加乳腺癌细胞对PTX、CBP的药物敏感性。根据芯片筛选的差异表达基因及miRNA靶基因预测软件,提示MDR1可能是miR-621的下游靶基因,调控乳腺癌细胞的药物敏感性。Western Blot实验证实MDR1蛋白表达水平在miR-621表达上调的细胞中显著下调。研究结论：miR-621参与调节乳腺癌对紫杉醇及卡铂治疗的敏感性,miR-621表达水平的上调可显著增加乳腺癌细胞对紫杉醇及卡铂的药物敏感性。MDR1可能是miR-621的靶基因,通过调节药物转运参与调控乳腺癌细胞的药物敏感性。miR-345在乳腺癌药物敏感性调控中具有一定的作用,需进一步研究证实。