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将植物纤维水解液中30%左右的木糖有效利用转化为酒精是降低酒精生产成本的关键。树干毕赤酵母是研究得最多、最具工业应用前景的木糖发酵酵母,目前对于树干毕赤酵母木糖代谢的生理学机制还知之甚少。以cDNA文库为基础的EST（Expressed Sequence Tag,表达序列标签）技术是一种快速的进行基因功能分析及发现新基因的有效方法。本论文构建了树干毕赤酵母P5776（Pichia Stipitis CBS 5776）的cDNA 文库,并以该文库为材料进行了大规模的5′端EST序列测定,为酵母的基因功能分析、木糖代谢途径研究以及筛选有关性状基因提供了基础工具。以具有不同生长速率的树干毕赤酵母为材料提取RNA,发现处于对数中期（OD600 约为2.1）的酵母细胞易于提取出总RNA;分别以匀浆法、玻砂法、液氮研磨法以及液氮速冻加液氮研磨的方法破碎细胞,再分别以TRIZOL（苯酚和异硫酸氰胍的均一混合物）和变性裂解液（主要成分是β-巯基乙醇和异硫酸氰胍）为试剂在溶解P5776 细胞组分的同时保持其中RNA的完整性,通过苯酚和氯仿多次抽提除净杂蛋白,以异丙醇沉淀回收特异的保留在水层中的RNA,最后经乙醇洗涤得到备用RNA。结果发现,运用变性裂解液,采取液氮速冻加液氮研磨的方法提取酵母细胞RNA,效果良好。本论文以约900mg（干重）酵母为材料提取获得了约1.2mg总RNA,提取得率达到1.3‰,提取出的RNA具备完整性,质量高,是cDNA文库构建的良好材料。以提取出的RNA为材料,纯化出mRNA（messager RNA, 信使RNA）,经反转录酶反转录出cDNA 第一链,以置换合成法合成cDNA 双链,通过胶纯化回收的方法筛选出其中大于500bp 的片段与载体连接,最后用电转化法转化宿主菌,构建出树干毕赤酵母P5776的cDNA文库,经质量检测,初级文库滴度达到1.0×106pfu（plaque forming units, 噬菌斑形成单位）/mL,扩增文库总克隆数达到1.25×109,文库中71%的重组子插入片段大于300bp,达到cDNA 文库构建要求,完全可以用于大规模EST序列测定及数据分析。将扩增好的P5776 cDNA文库铺布蓝白斑筛选平板,挑取其中的白斑（即重组子）经活化培养后,运用Vitagene 96-easy质粒DNA制备试剂盒以碱裂解法共提取出58 板（96孔板）,即5,000 余个重组子克隆的高质量质粒DNA;提取好的质粒以T3（连接载体上具有该引物RNA聚合酶启动子）为引物经PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）扩增出重组子插入片段,标记上荧光染料后在ABI Prism 3100 测序仪上经毛细管电泳完成了5,000 余条5′端EST 序列的测定工作,初步筛选出4,747 条质量较好的EST序列,经筛选得到的EST中90%以上具有大于500bp 的可读序列,每一EST序列中不可读碱基数小于5%。今后主要工作设想是进行EST数据分析,并结合cDNA 文库制备树干毕赤酵母DNA芯片,为木糖发酵酵母的生物信息学研究提供基础。