抗猪传染性胃肠炎病毒中草药的筛选及作用机制初步研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:phoebe_1012
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[目的]猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的以腹泻、呕吐、脱水、2周龄以内的仔猪死亡率高为特征的一种高度接触性急性传染病,给养猪业带来严重危害。本研究通过细胞培养初步建立了TGEV体外感染模型,从常见的抗病毒中草药中筛选药物进行体外抗病毒试验,筛选出具有抗TGEV作用的中草药,为临床用药提供理论依据。[方法](1)培养PK-15细胞,当细胞长成单层后,接种TGEV病毒,每天观察细胞生长情况。在细胞上盲传若干代数使之产生明显的细胞病变(CPE),然后反复冻融3次,收集病毒液置-70℃保存备用。根据TGEV的sM基因和ORF7之后的3′-UTR保守区域设计合成两对引物,对TGEV进行RT-PCR检测,并对扩增的3′-UTR非编码序列片段进行核酸测序鉴定。将TGEV疫苗免疫小鼠制备血清,通过间接免疫荧光试验检测TGEV。(2)从常见的具有抗病毒功能及临床上治疗TGE的中草药中筛选抗TGEV药物。将单药分别进行水提,水提物的终浓度为100mg/mL,高压灭菌后4℃贮存备用。中药提取物用细胞维持液2倍梯度稀释,将中药与长满单层的PK-15细胞于5%CO2、37℃培养箱内作用72h。最终,通过观察细胞形态、细胞单层是否完整对提取物的细胞毒性进行评价,确定药物的最大安全浓度(TC0)。(3)以药物的最大安全浓度为起点,将中药提取物用细胞维持液2倍梯度稀释成不同浓度,然后按三种不同方式(即先加中药后加病毒、先加病毒后加中药、病毒和中药同时加入)于长满单层的PK-15细胞中加入中药和病毒,作用72h后,观察中药对病毒致细胞病变的影响,并通过MTT法检测剩余活细胞的数量,再通过T检验比较加药组和病毒对照组的OD值,确定药物抗病毒最小浓度,计算药物的抑制指数和细胞保护率,分析中药体外抗TGEV活性。[结果](1)TGEV在PK-15细胞上盲传四代后产生明显的细胞病变,表现为细胞变圆、脱落、拉网等,而对照细胞形态仍为不规则的三角形,细胞单层完整。通过对细胞培养物的PCR扩增,得到大小为516bp、346bp的两条预期条带。对3′-UTR非编码序列进行核酸序列测序并与TGEV的其他毒株的该同源序列进行序列对比,同源性达97%~99%。间接免疫荧光试验检测接毒细胞可以看到特异性绿色荧光。通过以上试验证明了有TGEV存在。初步建立起用于筛选抗TGEV中草药的细胞模型。(2)通过形态学观察表明,中草药提取物一般在高浓度(>25 mg/mL)下使PK-15细胞单层受到破坏,细胞形态发生改变;低浓度下细胞则正常。和正常对照细胞相比,中药提取物对细胞的安全浓度一般在6.25~12.5mg/mL之间,但黄芪的安全浓度较大,当浓度高达50mg/mL时,细胞形态仍然正常。(3)根据MTT法检测结果,通过T检验分析表明,能抑制病毒吸附的药物有:黄芪、黄芩,抑制指数分别为:4、4。能直接杀灭病毒的药物有:大黄、金钱草、重楼,抑制指数分别为:8、8、16。但尚未筛选出能抑制病毒复制的中药。[结论](1)TGEV在PK-15细胞上盲传四代,产生明显的细胞病变,并通过PCR、测序、间接免疫荧光等方法对病毒予以证实。(2)中药对PK-15细胞的毒性检测结果表明,这些中药的最大安全浓度多在6.25~12.5mg/mL范围内,而黄芪的安全浓度较高,浓度达50mg/mL时细胞仍不受影响。(3)体外抗病毒试验表明,能抑制病毒吸附的中药有:黄芪、黄芩;能够抑制病毒复制的中药尚未筛选到;可以直接杀灭病毒的中药有:大黄、金钱草、重楼。
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