背景缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一种常见呼吸系统疾病,主要表现为肺血管阻力的增加,肺血管结构重建,肺动脉压力的进行性升高。到目前为止,临床上还没有能够根治肺动脉高压的确切的治疗方法,HPH已成为目前亟待研究并予以解决的一项重大难题。活性氧(reactive oxygen species,ROS)在HPH病理发展过程中的重要作用日益受到人们的关注。长期处于低氧状态下会引发缺氧诱导动物模型的肺组织及肺动脉中产生大量ROS,而一些类似抗氧化酶的化合物在动物实验中已经证明对HPH具有良好的治疗作用。因此,清除由低氧诱导产生的过量ROS可作为治疗HPH的一种有效方法。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是从葡萄籽中提取的天然多酚类化合物。GSPE是迄今发现的植物来源的最高效的抗氧化剂之一,具有广泛的抗自由基和氧化应激的生理学及药理学活性。并且GSPE在心血管诸多疾病中的保护及治疗作用已得到广泛证实。虽然GSPE已被证明具有清除ROS活性及心血管保护作用,然而GSPE对HPH是否具有抑制作用目前尚无相关报道。本课题将通过建立缺氧性肺动脉高压动物模型来初步研究GSPE对HPH的抑制作用及其可能机制。目的通过观察葡萄籽原花青素对缺氧性肺动脉高压大鼠模型的肺动脉压力的变化,右心室肥厚程度及肺血管结构重建的影响,探讨葡萄籽原花青素对缺氧性肺动脉高压的治疗作用及其可能机制。方法1.缺氧性肺动脉高压大鼠模型的建立及分组。28只雄性Sprague-Dawley大鼠(200-250g)随机分成4组,每组7只:(1)常氧组;(2)常氧给予GSPE组;(3)低氧组;(4)低氧给予GSPE组。第(2)和第(4)组大鼠在实验前1周及实验4周连续给予GSPE(每日250mg/kg)灌胃。2.大鼠肺动脉血液动力学及组织形态学检测。将大鼠低氧处理4周后,经右心室插入导管检测右心室平均收缩压力(rvsp)。取出大鼠心脏,分离出右心室(rv),左心室+室间隔(lv+s),计算其比值(rv/lv+s)作为右心室肥厚指标。大鼠肺组织经多聚甲醛固定,石蜡包埋,进行he染色。用imageproplus病理图像分析系统测量肺动脉外径、内径、中膜面积、血管面积,并计算中膜厚度(wt%)及面积(wa%)百分比以代表肺动脉增厚程度。3.大鼠肺组织免疫组化染色。大鼠肺组织经固定、包埋后利用α-肌动蛋白(α-sma)抗体及pcna抗体进行免疫组化染色。4.测定肺组织及血清中的丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)含量。5.原代肺动脉平滑肌细胞的培养及分组。利用组织块贴壁法培养原代肺动脉平滑肌细胞(pasmcs),并取3至6代用于实验。将细胞分成6组:常氧组;低氧组;低氧+20μg/mlgspe组;低氧+40μg/mlgspe组;低氧+80μg/mlgspe组;以及低氧+120μg/mlgspe组。6.检测各组pasmcs中的ros含量。将细胞在常氧或低氧条件下培养12小时后,利用dcfh-da探针及流式细胞仪检测各组pasmcs中的ros含量。7.利用台盼蓝排斥实验检测pasmcs在低氧条件下的增生情况以及葡萄籽原花青素对pasmcs增生的抑制作用。8.应用westernblot技术检测各组pasmcs中的p-stat3、cyclind1,以及cyclind3蛋白的表达情况。9.应用qrt-pcr技术检测各组大鼠肺组织及pasmcs中的nox4mrna的表达变化。结果1.低氧组大鼠rvsp、rv/lv+s、wt%,以及wa%明显高于常氧组及常氧+gspe组大鼠,然而低氧+gspe组大鼠rvsp、rv/lv+s、wt%,以及wa%均明显低于单纯低氧组大鼠。2.通过image-proplus图像分析软件系统进行图像分析显示,低氧组大鼠肺动脉α-sma光密度值明显高于常氧组及常氧+gspe组大鼠,而低氧+gspe组大鼠肺动脉α-sma光密度值则明显低于单纯低氧组大鼠肺动脉α-sma光密度值。3.低氧组大鼠肺组织及血清中的SOD含量较常氧组及常氧+GSPE组明显降低,而MDA含量则明显增高。在给予GSPE治疗后,大鼠肺组织及血清中的SOD含量明显增高,而MDA含量则明显降低。4.在体外实验中,流式细胞仪检测结果显示,与常氧组相比较,低氧组PASMCs内的ROS含量明显升高,然而低氧+GSPE组PASMCs内的ROS含量较低氧组明显降低。5.低氧组大鼠肺组织及低氧组PASMCs中的NOX4 mRNA水平较常氧组大鼠肺组织及常氧组PASMCs明显增高,而低氧+GSPE组大鼠肺组织及低氧+GSPE组PASMCs中的NOX4 mRNA水平较低氧组大鼠肺组织及低氧组PASMCs明显降低。6.低氧组大鼠肺动脉中PCNA阳性细胞数明显高于常氧组及常氧+GSPE组大鼠肺动脉中PCNA阳性细胞数。另外,与常氧组相比较,低氧明显促进了低氧组PASMCs的增生。在给予GSPE治疗后,不但低氧组大鼠肺动脉中PCNA阳性细胞数明显减少,低氧+GSPE组PASMCs的增生明显受到了抑制。7.与常氧组相比较,低氧组PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表达明显升高,低氧+GSPE组PASMCs的p-STAT3、cyclin D1以及cyclin D3的蛋白表达较低氧组明显下降。结论1.葡萄籽原花青素抑制了低氧诱导的缺氧性肺动脉高压模型大鼠的肺动脉结构重建及肺动脉压力的升高。2.葡萄籽原花青素抑制了低氧诱导的缺氧性肺动脉高压模型大鼠的氧化压力。3.葡萄籽原花青素降低了低氧诱导的NOX4 mRNA在肺动脉平滑肌细胞及肺组织中的高表达。4.葡萄籽原花青素抑制了低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的过度增生。背景缺氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是以肺动脉的持续收缩、结构重建及肺动脉压力进行性升高为特征的一种严重呼吸系统疾病。由低氧引起的肺部炎症反应及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的过度增生,在HPH的病理发展过程中起着非常重要的作用。褪黑激素(melatonin),属于吲哚杂环类化合物,是主要由松果体分泌的一类内分泌激素。大量研究证明,褪黑激素在机体的一些重要的生理和病理发展过程中发挥着至关重要的作用,如调节机体的昼夜节律、抑制肿瘤的生长及转移、抑制炎症、抑制细胞过度增生等。在心血管系统,褪黑激素的保护作用主要是通过清除活性氧自由基、抗氧化功能。虽然褪黑激素具有保护心血管、抑制炎症、抑制细胞增生的作用,但褪黑激素是否能够抑制HPH的发生与发展、抑制HPH中的炎症反应及PASMCs的过度增生,到目前为止尚无相关报道。本课题将通过建立缺氧性肺动脉高压动物模型来初步研究褪黑激素对HPH的抑制作用及其可能机制。目的通过观察褪黑激素对缺氧性肺动脉高压大鼠模型的肺动脉压力的变化,右心室肥厚程度及肺血管结构重建的影响,探讨褪黑激素对缺氧性肺动脉高压的治疗作用及其可能机制。方法1.缺氧性肺动脉高压大鼠模型的建立及分组28只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分成4组,每组7只:(1)常氧组;(2)常氧给予褪黑激素组;(3)低氧组;(4)低氧给予褪黑激素组。第(2)和第(4)组大鼠在实验前1周及实验4周连续给予褪黑激素(每日15mg/kg)腹腔注射。2.大鼠肺动脉血液动力学及组织形态学检测将大鼠低氧处理4周后,经右心室插入导管检测右心室平均收缩压力(RVSP)。取出大鼠心脏,分离出右心室(RV),左心室+室间隔(LV+S),计算其比值(RV/LV+S)作为右心室肥厚指标。大鼠肺组织经多聚甲醛固定,石蜡包埋,进行HE染色。用Image Pro Plus病理图像分析系统测量肺动脉外径、内径、中膜面积、血管面积,并计算中膜厚度(WT%)及面积(WA%)百分比以代表肺动脉增厚程度。3.大鼠肺组织免疫组化染色大鼠肺组织经固定、包埋后利用α-肌动蛋白(α-SMA)抗体、PCNA抗体、HIF-1α抗体,以及NF-κB p65抗体进行免疫组化染色。4.原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的培养及低氧处理利用组织块贴壁法培养原代PASMCs,并取3至6代用于实验。实验中将细胞在21%氧或2%氧条件下持续培养48小时。5.利用MTT实验检测PASMCs在低氧条件下的增生情况以及褪黑激素对PASMCs增生的抑制作用。6.应用Western blot技术检测常氧及低氧条件下的PASMCs中的p-Akt和pERK,以及肺组织中NF-κB p65蛋白的表达情况。7.应用q RT-PCR技术检测各组大鼠肺组织中的HIF-1αm RNA的表达变化。结果1.低氧组大鼠RVSP、RV/LV+S、WT%,以及WA%明显高于常氧组及常氧+褪黑激素组大鼠,然而低氧+褪黑激素组大鼠RVSP、RV/LV+S、WT%,以及WA%均明显低于单纯低氧组大鼠。2.通过Image-Pro Plus图像分析软件系统进行图像分析显示,低氧组大鼠肺动脉α-SMA光密度值及PCNA阳性细胞数明显高于常氧组及常氧+褪黑激素组大鼠,而低氧+褪黑激素组大鼠肺动脉α-SMA光密度值及PCNA阳性细胞数则明显低于单纯低氧组大鼠。3.低氧明显提高了HIF-1α在肺动脉中层平滑肌细胞中的表达,以及HIF-1αm RNA在肺组织中的表达。然而褪黑激素明显抑制了HIF-1α的表达水平。4.低氧组大鼠肺组织中NF-κB p65的表达水平较常氧组明显升高,褪黑激素明显抑制了NF-κB p65在肺组织中的表达。5.与常氧组相比较,低氧明显促进了低氧组PASMCs的增生。在给予褪黑激素后,PASMCs的增生明显受到了抑制。6.与常氧组相比较,低氧组PASMCs的p-Akt和p-ERK的蛋白表达明显升高,低氧+褪黑激素组PASMCs的p-Akt和p-ERK的蛋白表达较低氧组明显下降。结论1.褪黑激素抑制了低氧诱导的缺氧性肺动脉高压模型大鼠的肺动脉结构重建及肺动脉压力的升高。2.褪黑激素抑制了低氧诱导的缺氧性肺动脉高压模型大鼠的肺部炎症反应。3.褪黑激素抑制了低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的过度增生。