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目的:
随着糖尿病的发病率逐年增加,由糖尿病引发的骨质疏松症也日益增多,研究其发病机理及药物防治有着重要意义。糖尿病高血糖以及晚期糖基化终末产物增加引起成骨细胞活性的改变可能是糖尿病性骨质疏松发病的重要因素。骨碎补总黄酮为常用治疗骨质疏松中药骨碎补的主要活性成分,它能否改变高血糖以及晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞活性的研究尚未见报道,本研究探讨骨碎补总黄酮对高糖、晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞活性的影响,及与分化相关的骨形态发生蛋白、骨保护素以及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号蛋白的研究,明确骨碎补总黄酮是否对高糖、晚期糖基化终末产物作用下的成骨细胞具有干预作用,并进一步探讨其作用机制,为骨碎补能否用来防治糖尿病性骨质疏松提供细胞分子学依据。
方法:
1.酶消化法原代新生SD大鼠颅骨成骨细胞的分离培养以及活性观察。
2.MTT法检测骨碎补总黄酮对成骨细胞的细胞毒性,根据细胞抑制情况确定实验用药物在培养基中的添加剂量。
3.CCK-8检测细胞活力、流式细胞仪方法检测细胞周期,研究骨碎补总黄酮对成骨细胞增殖的影响。
4.pNPP法检测骨碎补总黄酮对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响,ELISA法检测骨碎补总黄酮对成骨细胞Ⅰ型胶原和骨钙素的影响,茜素红染色计数矿化结节研究骨碎补总黄酮对成骨细胞矿化的影响。
5.分别用MTT法、pNPP法、ELISA法、流式细胞仪、吖啶橙染色法、茜素红染色法检测不同浓度的葡萄糖和晚期糖基化终末产物对成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素、凋亡以及矿化能力的影响。
6.分别应用 MTT法、pNPP法、ELISA法、茜素红染色法研究骨碎补总黄酮对不同浓度的葡萄糖、晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞的增殖、分化、矿化活性。
7.实时荧光定量PCR检测骨碎补总黄酮对高糖、晚期糖基化终末产物作用下BMP-2、OPGmRNA的表达,探讨骨碎补总黄酮促成骨细胞分化的可能机制。
8.Westem-blot检测骨碎补总黄酮对高糖、晚期糖基化终末产物作用下,p38MAPK和ERK1/2的蛋白磷酸化情况,评价它们在骨碎补总黄酮促成骨细胞增殖、分化过程中的作用。
结果:
1.原代分离培养新生SD大鼠成骨细胞,可以获得实验用的纯度较高的成骨细胞,具有典型的成骨细胞增殖和分化特性。
2.骨碎补总黄酮对成骨细胞毒性的检测,得出骨碎补总黄酮对成骨细胞的IC50浓度为5266mg/L,培养基中骨碎补总黄酮含量在162.4mg/L浓度以下则对成骨细胞生长无明显抑制,因此培养基中骨碎补总黄酮的浓度选择为25mg/L、50mg/L、100mg/L的实验梯度浓度。
3.CCK-8和流式细胞仪细胞周期检测,得出骨碎补总黄酮25mg/L、50mg/L、100mg/L浓度组的成骨细胞活力和细胞增殖指数明显增加,与对照组比较在统计学上差异有显著性意义(P<0.01或0.05)。
4.在骨碎补总黄酮作用成骨细胞一定时间后,25mg/L、50mg/L、100mg/L浓度组成骨细胞的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素的表达以及矿化结节计数与对照组比较,在统计学差异上有显著性意义(P<0.01或0.05)。
5.在骨碎补总黄酮作用成骨细胞一定时间后,培养基中不同浓度的葡萄糖(25mmol/L、50mmol/L)可以抑制成骨细胞增殖,降低成骨细胞表达碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素,诱导其凋亡,降低其矿化能力。
6.在骨碎补总黄酮作用成骨细胞一定时间后,培养基中不同浓度的晚期糖基化终末产物(200mg/L、400mg/L、800mg/L)可以抑制成骨细胞增殖,降低成骨细胞表达碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素,诱导其凋亡,降低其矿化能力。
7.骨碎补总黄酮(50mg/L、100mg/L)可以剂量和时间依赖性的提高葡萄糖和晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞增殖以及表达碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原、骨钙素和矿化能力。
8.骨碎补总黄酮(50mg/L)可以提高对高糖、晚期糖基化终末产物作用下BMP-2、OPGmRNA的表达。骨碎补总黄酮(50mg/L)可以提高对高糖、晚期糖基化终末产物作用下 p38MAPK和ERK1/2的蛋白磷酸化。
结论:
1.在一定浓度(25mg/L、50mg/L、100mg/L)下,骨碎补总黄酮可以促进成骨细胞的增殖。
2.在一定浓度(25mg/L、50mg/L、100mg/L)下,骨碎补总黄酮可以促进成骨细胞分化,提高其矿化能力。
3.在一定浓度下,葡萄糖(25mmol/L、50mmol/L)可以抑制成骨细胞增殖,降低成骨细胞分化能力,诱导其凋亡,降低其矿化能力。
4.在一定浓度下,晚期糖基化终末产物(200mg/L、400mg/L、800mg/L)可以抑制成骨细胞增殖,降低成骨细胞分化能力,诱导其凋亡,降低其矿化能力。
5.骨碎补总黄酮(50mg/L、100mg/L)可以剂量和时间依赖性的提高葡萄糖、晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞增殖、分化和矿化能力。
6.骨碎补总黄酮对葡萄糖、晚期糖基化终末产物作用下成骨细胞活性的影响可能和促进 BMP-2、OPGmRNA的表达,提高p38MAPK和 ERK1/2信号蛋白的磷酸化有关。