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目的：miR-1和miR-133存在于大多数动物种系,特异性表达于心肌和骨骼肌。有文献表明它们调节心肌和骨骼肌细胞的分化和增殖,但是否参与人类心脏疾病相关的病理性细胞凋亡不清。普萘洛尔与卡维地洛可通过多种机制产生细胞保护作用,但miRs是否参与其中不十分清楚。本研究目的在于确定miR-1、miR-133对细胞凋亡是否有调节作用,同时探讨普萘洛尔与卡维地洛对心肌细胞保护作用的机制。
方法：(1)利用腺病毒转染技术观察miR-1和miR-133的细胞转染效率。(2)利用TUNEL法和MTT法观察miR-1、miR-133、AMO-1、AMO-133对细胞凋亡的影响。(3)利用计算机和生物信息方法,对miR-1、miR-133的作用靶点进行预测,在mRNA及蛋白水平上对预测的作用靶点进行研究。(4)利用MTT法检测普萘洛尔与卡维地洛对H2O2导致的细胞凋亡的影响。(5)利用Real-Time PCR检测普萘洛尔、卡维地洛对miR-1、miR-133的影响；利用Western blotting技术观察普萘洛尔、卡维地洛对miR-133下游靶点的影响。(6)观测普萘洛尔对miR-1导致心律失常的调节作用。
结果：(1)H2O2使H9C2细胞内miR-1、miR-133含量明显增加,如果给予AMO则使miRs含量降低。(2)将携带miRs的腺病毒进行细胞转染后,可见GFP蛋白明显表达,出现绿色荧光。如果对转染后细胞内的miRs进行检测,发现细胞内miRs含量明显升高。(3)转染miR-1可以导致明显的细胞凋亡,降低细胞存活率,降低H2O2的半数抑制浓度；转染miR-133可以提高细胞存活率,升高H2O2的半数抑制浓度；共同转染miR-1、miR-133则会减轻miR-1导致的细胞凋亡,不影响H2O2导致的细胞凋亡；转染AMO后,可抑制miRs的作用。(4)miR-1可使Ik1电流降低,如果同时给予AMO-1会使降低的电流恢复正常。(5)利用计算机和生物信息技术预测miR-1对细胞凋亡产生作用可能通过两个候选靶点:HSP60,HSP70,而miR-133的候选靶点为caspase-9。(6)实验证明,miR-1可以明显降低H9C2细胞73％HSP60及53％HSP70蛋白量,如同时应用AMO-1可取消miR-1对HSP60、HSP70的作用。与之相对比,miR-133可降低89％caspase-9蛋白量,如同时转染AMO-133可取消miR-133对caspase-9的作用。在H9C2细胞单独应用AMO可以增加HSP60,HSP70和caspase-9含量。在mRNA水平,HSP60,HSP70的mRNA含量不受miR-1影响,而miR-133可以降低caspase-9的mRNA含量。(7)普萘洛尔、卡维地洛可明显抑制H2O2所导致的细胞凋亡,提高细胞生存率,同时可以降低细胞内miR-1、miR-133含量,降低caspase-9蛋白含量。(8)普萘洛尔可以明显减少大鼠由于注射miR-1而出现的心律失常。
结论：(1)H2O2导致的细胞凋亡可使细胞内miR-1、miR-133含量增加。(2)miR-1通过HSP60、HSP70促进细胞凋亡,miR-133通过caspase-9起到细胞保护作用,AMO为miRs特异性的拮抗物质。(3)miR-1主要影响靶基因的翻译过程,对转录过程没有影响；miR-133可以影响靶基因的转录与翻译过程。(4)普萘洛尔、卡维地洛具有细胞保护作用。(5)普萘洛尔、卡维地洛可降低miR-1、miR-133的mRNA含量,其细胞保护作用可能与降低caspase-9蛋白含量有关。