肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand，TRAIL/Apo2L)是1995年被确认的肿瘤坏死因子超家族成员，在体外和体内，可溶性的TRAIL能迅速诱导一系列肿瘤细胞的凋亡，而对正常组织细胞无毒性，因而是一种很有应用前景的抗肿瘤蛋白。 (1)论文首先从锌离子对可溶性TRAIL表达的影响及对TRAIL活性的影响两方面进行了研究。结果发现，锌离子对于可溶性TRAIL蛋白的表达有着良好的促进作用。加入ZnSO4总量为1mmol/L时可溶性TRAIL表达量有近两倍的提高，而且此时所表达的蛋白活性也最高，对SW1990的细胞活性抑制率可达到80％以上。另外还发现，适宜的锌离子浓度对TRAIL蛋白三聚体的形成及结构稳定性有明显的改进作用。在纯化后的TRAIL溶液中添加4nmol/L的锌离子时，可以提高三聚体的含量，从而提高TRAIL对SW1990细胞的诱导凋亡作用。 (2)建立了基于碳氮源平衡的底物流加策略：一是以蛋白胨和酵母粉为有机氮源的C/N比流加策略的构建，并且研究了这种流加策略对TRAIL蛋白表达的影响；二是以NH4Cl为无机氮源的C/N比流加发酵策略的构建，同样也研究了其对TRAIL表达的影响。 a.在菌体生长的不同时期流加不同碳氮(有机氮源)比的碳源和氮源，从而实现碳氮源的实时流加平衡，最终获得高密度的菌体(最高菌体密度可达62.2g/L)和高表达的外源蛋白(可溶性TRAIL蛋白表达量在总蛋白中的比例可高达6.7％，TRAIL蛋白含量可达1.57g/L)。 b.论文还构建了以NH4Cl为无机氮源的C/N比流加发酵策略。当菌体C600-T生长阶段采用C/N(NH4Cl)为6、诱导阶段采用C/N(NH4Cl)为3的底物流加策略时，可溶性TRAIL表达量提高了65.2％。 c.研究还表明，采用有机氮源时，发酵过程中的最佳C/N比是变化的、上调的，而采用无机氮源时，发酵过程中的最佳C/N比是基本不变的。在诱导阶段，C/N比都需要下调，以提高可溶性TRAIL的表达量，减少TRAIL包涵体的生成量。 (3)论文对C/N(有机氮源)比流加过程中的蛋白质组学进行了研究。结果发现，菌体C600-T在生长过程中随着C/N(有机氮源)比的增加，菌体的能量代谢、DnaK和GroEL、大部分糖酵解途径酶、绝大部分与菌体自身蛋白合成相关的功能蛋白和参与细胞器生成的蛋白表达量随C/N比的升高而增大；而在诱导4h后，由于菌体比生长速率降低，同时外源蛋白TRAIL也基本停止表达，ATP合成酶、分子伴侣和部分糖酵解酶的表达量下降。 论文对C/N(无机氮源)比流加策略实施过程中的碳源代谢流进行了分析。结果发现，C/N(无机氮源)比对菌体的代谢流分布有较大影响。C/N=6时的乙酸产生途径碳流量高于C/N=3时的乙酸流量，说明流加C/N=6的培养基使得葡萄糖浓度明显高于C/N=3时的葡萄糖浓度，导致乙酸有一定的积累；由于乙酸的产生，流向TCA循环的碳流量相对分布略有减小，说明TCA循环的碳流量此时即将饱和，多余的碳源将以副产物的形式代谢。 (4)筛选到了一株PTA酶缺陷型突变株F34，将质粒pBV220-TRAIL转化至F34中，得到重组突变菌F34-T。F34-T菌体生长初期，比生长速率小于对照菌C600-T，但在对数生长期后期，开始高于C600-T，显示出后期生长优势；常规补料策略发酵显示，F34-T与对照C600-T相比单位发酵液中可溶性TRAIL蛋白表达量提高了37.5％。 2-D电泳分析结果显示，突变菌F34-T中的PTA酶没有表达，而与能量生成相关的ATP合成酶、与糖酵解途径相关的PTS系统蛋白、DNA复制相关的DNA-binding蛋白以及部分氨基酸合成相关的功能蛋白的表达量提高。这种现象表明，PTA缺陷型突变菌加强了糖酵解和氨基酸代谢途径，使得乙酸生成途径阻断后碳代谢流发生了偏移；同时，由于乙酸途径的缺失，菌体加强了ATP合成酶的表达量以弥补由于乙酸缺陷而造成的能量缺乏。 (5)将vgb基因引入EscherichiacoliC600-T中，成功构建了可同时表达TRAIL、VHb两种外源蛋白的重组Escherichiacoli基因工程菌C600-T-v，提高了菌体对氧的利用率，使得菌体密度和TRAIL蛋白产量(单位发酵液)提高了1.6倍以上。采用恒速流加补料策略，工程菌C600-T-v最终乙酸积累量为对照菌的55.6％，最高乙酸浓度仅为3.5g/L。 (6)在第(4)步和第(5)步实验的基础上，我们抽提重组菌C600-T-v的质粒pBV220-TRAIL-vgb，转化至突变菌FK34中，得到重组菌F34-T-v4，重组菌F34-T-v4中含有TRAIL基因和vgb基因，同时又是PTA酶缺陷型。3.7L发酵罐流加培养表明，在葡萄糖是限制性组分条件下，从单位体积发酵液的可溶性TRAIL表达量方面看，F34-T-v4具有明显优势，分别为C600-T-v的1.33倍和C600-T的2.32倍，达到1.74gTRAIL/L发酵液，可溶性TRAIL表达量的提高主要得益于菌体密度的提高。 最终，可溶性TRAIL的表达量为1.74g/L，流加发酵过程中乙酸浓度基本为0，最高菌体密度为62.2g/L。多阶段C/N流加发酵可以使可溶性TRAIL表达量提高1倍以上；vgb基因和PTA缺陷型突变菌在产可溶性TRAIL过程中的作用主要是通过提高菌体密度来实现的。