糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病患者常见和最严重的并发症,其发病率和死亡率高,也是我国慢性肾功能不全的主要病因。DKD的发病机制尚不完全清楚。二甲双胍除了降血糖外,还可以降低早期DKD的尿蛋白排泄从而保护肾脏。二甲双胍的肾保护作用与其抑制AMPK/mTOR信号通路密切相关。Klotho是抗衰老基因,其表达的klotho蛋白在肾脏远曲小管产生。随着肾脏病进展,DKD患者的klotho蛋白表达下降,而klotho的下降可激活mTOR信号通路加重肾脏损伤。故推测,二甲双胍是通过上调klotho来调节mTOR通路,保护肾小管细胞,从而延缓DKD患者的肾进展。我们通过观察二甲双胍干预对于DKD患者血、尿klotho蛋白及肾损伤进展的影响,分析DKD小鼠klotho蛋白与肾脏病理损伤之间的关系,并在细胞水平分析高糖及二甲双胍对于狗远曲小管上皮细胞(MDCK)klotho蛋白表达及mTOR通路的影响,初步探讨二甲双胍与klotho蛋白在DKD进程中可能的肾保护作用机制,为临床应用二甲双胍治疗DKD提供理论依据。临床研究中我们发现二甲双胍可以改善部分DKD患者的肾脏预后,考虑到DKD患者的临床医学数据的不平衡性和医学模型的可解释性,我们提出了具备不平衡学习能力及高度可解释性的不平衡0阶TSK模糊系统(unbalanced 0-oeder Takagi–Sugeno–Kang fuzzy system,UB-0-TSK-FS),该系统属于人工智能领域的机器学习方案,能够构建关于DKD患者的分类预测模型。该模型将成为辅助医生监测DKD病程的重要工具,同时也为肾内科医生在智能诊断方面提供一种解决方案。第一部分二甲双胍对糖尿病肾病患者klotho蛋白和肾损伤进展的影响目的:观察二甲双胍干预对于DKD患者klotho蛋白及肾损伤进展的影响,分析二甲双胍与klotho蛋白在DKD患者肾功能进展的关系。方法:前瞻性收集2017年1月至2017年7月至南京医科大学附属无锡市人民医院肾内科和内分泌科就诊的DKD患者80例,健康对照者20名。根据是否服用二甲双胍,将DKD患者分为二甲双胍组、非二甲双胍组。收集患者就诊时的血尿标本,ELISA法检测其klotho蛋白的水平,比较各组患者的临床指标和血、尿klotho浓度的差异。随访一年后DKD患者的肾功能进展情况,观察指标是尿蛋白进展及血肌酐翻倍。通过多元Logister回归分析klotho蛋白与DKD患者一年后肾损伤进展的关系。结果:1、一年后,DKD患者中50.0%出现尿蛋白进展,37.5%出现血肌酐翻倍。二甲双胍组中40.0%出现尿蛋白进展,30.0%出现血肌酐翻倍;非二甲双胍组60.0%出现尿蛋白进展,45.0%出现血肌酐翻倍,两组出现终点事件的概率无明显差异(P尿蛋白进展=0.117,P血肌酐翻倍=0.248)。2、DKD患者的血清及尿液klotho蛋白水平明显低于健康对照组(489.87±288.64 vs 717.49±296.01pg/ml,703.96±649.86 vs 1588.34±1041.07pg/ml·Cr,P<0.05)。二甲双胍组患者的血清klotho蛋白水平(610.30±312.31pg/ml)明显高于非二甲双胍组(369.43±203.74pg/ml,P<0.001),但两组患者的尿klotho蛋白水平无差异(P=0.923)。3、直线相关分析表明血清klotho蛋白水平与糖尿病病程、24小时尿蛋白定量水平、血尿素及血肌酐水平呈负相关(r=-0.308、-0.311、-0.348、-0.355,p<0.05),与血白蛋白水平、服用二甲双胍呈正相关(r=0.209、0.460,p<0.05)。尿klotho蛋白水平与24小时尿蛋白定量、血尿素及血肌酐呈负相关(r=-0.413、-0.215、-0.230,p<0.05),与血白蛋白水平呈正相关(r=0.313,p<0.05)。4、多因素Logistic回归显示校正了年龄、糖尿病病程、糖化血红蛋白、平均动脉压、低密度脂蛋白胆固醇、血白蛋白、血尿素、血肌酐、24小时尿蛋白定量及尿klotho蛋白,血清klotho蛋白为DKD患者尿蛋白进展和血肌酐翻倍的独立预测因子(OD尿蛋白进展=1.010,P尿蛋白进展=0.002,OD血肌酐翻倍=1.002,P血肌酐翻倍=0.041)。结论:1、二甲双胍可提高DKD患者血klotho蛋白表达,但不能改变尿klotho蛋白水平。2、影响血清klotho蛋白水平的因素有糖尿病病程、24小时尿蛋白定量、血尿素、血肌酐、血白蛋白水平及服用二甲双胍。3、校正了年龄、糖尿病病程、糖化血红蛋白、平均动脉压、低密度脂蛋白胆固醇、血白蛋白、血尿素、血肌酐、24小时尿蛋白定量及尿klotho蛋白,血清klotho蛋白为DKD患者尿蛋白进展和血肌酐翻倍的独立预测因子。第二部分二甲双胍对糖尿病肾病小鼠肾保护机制的探讨目的:研究二甲双胍对DKD小鼠肾保护作用及可能的机制。方法:将十只db/db小鼠随机均分为二甲双胍组、非二甲双胍组,五只db/m小鼠为正常对照组,采用放免比浊分析法检测24小时尿微量白蛋白定量,酶法检测血肌酐,ELISA法检测血、尿klotho蛋白,HE及PASM染观察小鼠肾脏组织的病理变化,免疫组化法及western blot法进程肾脏组织的klotho、mTOR及p-mTOR蛋白水平。结果:1、DKD小鼠尿微量白蛋白定量及血肌酐明显升高(p<0.001),二甲双胍可降低其升高程度(p<0.05),改善DKD小鼠肾损伤。2、DKD小鼠血液及尿液klotho蛋白水平下降(p血<0.001,p尿=0.001),而二甲双胍干预后小鼠血液及尿液中klotho蛋白水平明显升高(P血<0.001,P尿=0.028)。3、DKD小鼠肾脏病理改变显示肾小球体积增大,基底膜僵硬,肾小管细胞、系膜细胞及基质增多。二甲双胍治疗后小鼠上述肾脏病理改变均有一定程度地减轻。4、DKD小鼠肾脏组织中klotho蛋白水平下降,mTOR及p-mTOR蛋白水平升高,而二甲双胍应用升高了小鼠肾脏组织中klotho蛋白,降低了mTOR及p-mTOR蛋白的表达。结论:二甲双胍可减缓DKD小鼠尿蛋白和血肌酐进展,提高血清、尿液及肾脏组织中的klotho蛋白,降低肾脏组织中的mTOR、p-mTOR蛋白表达,从而发挥保护肾功能的作用。第三部分二甲双胍对MDCK细胞高糖损伤的保护机制目的:在细胞水平分析二甲双胍对于高糖刺激下狗远曲肾小管上皮细胞(MDCK)klotho蛋白表达及mTOR通路的影响,初步探讨二甲双胍与klotho蛋白在DKD进程中可能的肾保护作用机制。方法:体外培养MDCK细胞,高糖刺激不同时间,观察细胞形态变化,MTT及Hoechst 33258染色检测细胞活性。不同浓度二甲双胍刺激MDCK细胞,Western blot检测各组细胞的mTOR、p-mTOR及klotho蛋白表达情况。并采用siRNA抑制klotho蛋白,Western blot检测高糖组和二甲双胍组细胞的mTOR、p-mTOR表达情况。结果:1、MDCK细胞呈多边形贴壁生长于细胞培养瓶中。30mmol/l高糖培养液刺激48h后,MDCK细胞失去固有形态,呈长梭形。Hoechst 33258染色显示正常对照组细胞核界限清楚,染色质分布呈均一的淡蓝色,而高糖刺激下MDCK凋亡细胞核浓染,亮度明显加深。随着时间延长,MDCK的细胞活力逐步下降,高糖刺激后48h后MDCK细胞损伤最大,平均细胞存活率为86.230%(p<0.001)。2、二甲双胍可提高高糖刺激下MDCK细胞的存活率,其中0.3μg/m L DMBG组细胞活性最高(p<0.001)。Hoechst 33258染色下0.3μg/m L DMBG组细胞活性最高,细胞核界限清楚,染色质分布呈均一的淡蓝色,而其余浓度DMBG组细胞核呈染色质分布不均匀,部分细胞核分叶、破碎,呈亮蓝色。3、高糖可下调klotho蛋白,上调mTOR、p-mTOR蛋白的表达。随着高糖刺激时间延长,MDCK细胞表达mTOR蛋白及p-mTOR蛋白水平逐步增加(p<0.001),这提示高糖刺激可激活MDCK细胞中mTOR通路。4、siRNA抑制klotho蛋白表达后,高糖培养组和二甲双胍干预组细胞的mTOR、p-mTOR蛋白水平无明显差异。结论:1、高糖可下调klotho表达,激活mTOR信号通路,损伤MDCK细胞,且损伤程度随着时间的延长而加重。2、二甲双胍可改善高糖对MDCK的损伤,其最佳浓度为0.3μg/m L。3、klotho在二甲双胍抑制mTOR通路保护肾功能的过程中具有重要作用。第四部分基于不平衡0阶TSK模糊系统的糖尿病肾病患者肾损伤智能分类目的:在肾脏学领域,DKD是糖尿病的常见并发症。因此,如果我们能开发出一种对DKD肾损伤患者的智能分类方法,它将成为辅助医生监测该病病程的重要工具。方法:由于DKD患者数据集的显现分布不平衡的特性,本章节提出了一种基于Havrda-Charvat熵的不平衡模糊学习机制,进而结合经典0阶TSK模糊系统的训练算法提出了一种新的具备不平衡数据学习能力的0阶TSK模糊系统训练算法,称之为UB-0-TSK-FS模型。结果:所提出的UB-0-TSK-FS模型继承了经典的0阶TSK模糊系统的可解释性,有助于医师理解系统的语意逻辑。结论:所提出的UB-0-TSK-FS模型较之经典的几种机器学习算法具有最佳的分类性能,待经过终试测试后具有良好的临床辅助诊断应用前景。