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本文主要包括链霉菌SH-62中活性天然产物生物合成基因簇的克隆和异源表达以及抗肿瘤抗生素azinomycin B生物合成调控机制的初步研究这两部分内容:一、链霉菌SH-62中活性天然产物生物合成基因簇的克隆和异源表达从土壤中分离得到的链霉菌SH-62具有较好的生物活性。全基因组测序分析发现该链霉菌基因组中含有多个PKS和NRPS基因簇。为了对这些天然产物生物合成基因簇展开研究,我们建立了链霉菌SH-62的遗传操作系统,通过接合转移的方法,以大肠杆菌DCDH/pUZ8002为供体宿主菌,可以将温敏型质粒pKC1139以较低的效率(4.1×10-8个接合子/受体)导入链霉菌SH-62。同时从链霉菌SH-62的基因组BAC文库中,通过PCR筛选得到132个包含有NRPS/PKS基因的克隆子。然后通过高通量接合转移的方法将132个BAC质粒导入到S.livudans ZX1中进行异源表达及生物活性测定,筛选到31个对枯草芽孢杆菌有抑制作用的阳性克隆。根据BAC末端测序及酶切图谱分析,对31个阳性克隆的插入片段进行了定位及序列分析,发现它们来自于7个不同的NRPS/PKS活性天然产物的生物合成基因簇。其中一个杂合的NRPS/PKS生物合成基因簇(命名为lem)与雷纳霉素生物合成基因簇(lnm)存在较高的同源性。通过生物信息学分析我们找到了三个相关的contig并补齐了其中的gap,得到了完整的基因簇序列。lem基因簇与lnm基因簇比较分析发现它们在NRPS/PKS母核以及后修饰基因上存在着一定的差别,lem基因簇可能负责一个新的大环内酰胺类抗生素的生物合成。将包含有lem基因簇的BAC质粒15E11和18D5分别导入S.lividans、S.albus、ΔaziD和△aziU3进行异源表达,最终在△ aziD2和Δ aziU3中异源表达成功,异源表达产物的结构还有待进一步的分析。二、抗肿瘤抗生素azinomycin B生物合成调控机制的初步研究Azinomycin B 是由Streptomy sahachiroi ATCC3318 所产生的次级代谢产物,其独特的化学结构、显著的抗肿瘤活性和新颖的作用机制使得该抗生素具有较高的研究价值。通过生物信息学分析在azinomycin B的生物合成基因簇找到了三个可能的调控基因,其中orf7是一个TetR家族的转录调控因子,orf9为HxlR家族的转录调控因子,orfl213是一个双组份调控因子。本研究利用遗传学及分子生物学对azinomycin B生物合成的调控机制进行了初步的研究。通过orf7、orf9和orf12的基因敲除及超量表达证实这三个调控基因与azinomycin B的生物合成无关。半定量RT-PCR分析的结果也进一步的证实了与野生型菌株相比,在基因敲除突变菌株中负责azinomycinB生物合成的部分结构基因aziA4、aziE、aziC7、aziB、aziU1、orf7、orf9和orf12在转录水平上没有发生变化。利用启动子探针载体,对位于azinomycin B生物合成基因簇中的14个可能的启动子区域进行了分析,通过检测报告基因egfp的表达,证实其中有12个具有启动子活性。在原宿主菌S.sahachiroi和异源表达菌株S.lividans ZX1中检测PaziA2、PaziG、PaziC4和、Porf3这四个启动子在不同培养时间的表达活性,发现它们的表达趋势与链霉菌中常用的组成型表达的启动子PermE*相同,初步推测azinomycin B的生物合成可能不受途径特异性调控因子的调控,而是组成型的表达。