阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)又称老年性痴呆，是一种主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变等的神经系统退行性疾病。AD的病因及发病机制尚未完全阐明，目前认为是由遗传和环境等多种因素引起的。AD的神经病理学特征主要包括神经元的大量丢失伴胶质细胞增生、细胞外异常淀粉样β（β-amyloid protein，Aβ）蛋白聚集形成的老年斑(senile plaque，SP)沉积和由细胞内超磷酸化tau蛋白组成的神经纤维缠结等。其中，Aβ蛋白的杂乱聚集是阿尔兹海默症发生发展的关键环节，而Aβ前体蛋白(APP)基因在DNA水平的变异是造成Aβ增加的主要原因。随着人口老龄化的进程，AD的发病率逐年上升，AD的防治是近年来研究的热点，而针对其有效的治疗药物依然缺乏。　　N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体对于神经元突触的可塑性的维持具有重要的作用，而研究表明Aβ寡聚物的作用依赖于NMDA受体的活化。盐酸美金刚(Memantine)是金刚烷(adamantine)的一种衍生物，作为NMDA受体的非特异性阻断剂，已被批准用于中度到重度AD的治疗。多项研究表明memantine可通过非特异性阻断突触后NMDA受体的作用来抑制依赖NMDA受体的Aβ肽诱导的神经毒性。也有研究显示在AD的动物和细胞模型中，美金刚还可通过不依赖于NMDA受体功能的抗细胞凋亡作用来发挥神经保护的作用。所以美金刚对AD起保护作用的机制尚不十分明确。　　自噬在AD中发挥的作用一直存在着争议，有的研究认为在AD的神经突中自噬的诱导增强和转运回神经元胞体的过程受阻，会导致自噬小体在受损神经突中大量积累。APP、β分泌酶和γ分泌酶在自噬小体中均有明显表达，反而增加了二者的相互作用时间，所以自噬成为新的Aβ产生途径，促进AD的发生和进展。也有研究显示通过自噬增强剂增强自噬作用，可减轻AD模型小鼠的认知功能障碍，并降低Aβ水平。细胞自噬上游调控通路主要有两种，一种是mTOR依赖的信号通路，即PI3K-Akt-mTOR信号通路;另一种为不依赖mTOR的信号通路，主要是由JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1复合物调控的信号通路。　　鉴于上述自噬在AD中发挥的作用存在争议以及memantine对AD治疗的作用机制尚不明确的现状。本课题建立过表达人瑞端突变型APP659蛋白的神经母细胞瘤细胞作为AD的细胞模型，明确在该AD模型中自噬对细胞具有保护作用还是具有促进其凋亡作用，同时探讨美金刚对AD细胞模型细胞的细胞凋亡、细胞自噬的作用以及通过何种信号通路来调控自噬作用，以此来揭示美金刚对细胞的保护作用机制，旨在为阿尔茨海默病的进一步预防、治疗及预后提供理论依据。　　研究方法:　　本实验分为三部分，首先在体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，瞬时转染建立过表达瑞典突变型APP695基因的AD细胞模型并鉴定。细胞转染后加入不同终浓度的memantine（1μM、5μM、10μM）处理后，MTT检测细胞的存活率。然后，使用memantine和自噬增强剂雷帕霉素共同处理转染细胞后，经流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，吖啶橙染色于激光共聚焦显微镜下观察自噬小体的生成情况，Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表达情况。最后，用memantine处理AD模型细胞后Western blot检测自噬信号通路蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1及JNK1的表达情况，免疫荧光单/双染观察细胞中Bcl-2和Beclin-1的定位。　　研究结果:　　一、 AD细胞模型的建立与鉴定　　复苏神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，使用APP695重组质粒及空质粒分别瞬时转染细胞，实验分为未转染组(Control)、转染试剂组(Mock)、空质粒转染组(NC)以及目的载体转染组(APP695)。细胞转染24h后，Real-time PCR检测各组细胞APP695的mRNA检测，48 h后Western blot检测各组细胞APP695蛋白的表达。　　结果显示:与Control组相比，APP695组APP695的mRNA及蛋白的水平均显著提高(P＜0.01)，而Mock组与NC组APP695蛋白的表达与Control组相比并无明显区别(P＞0.05)。　　二、 MTT法检测memantine对AD细胞模型细胞生存率的影响　　用不同浓度的memantine(1μM、5μM、10μM)处理转染APP695质粒以及对照组的细胞，24 h、48h后MTT实验检测各组细胞的存活率。结果显示:与对照组相比，APP695质粒转染后细胞的存活率明显下降(P＜0.05)，而经memantine处理后细胞的存活率明显升高(P＜0.05)，且具有剂量依赖性。并确定5μM为memantine最适使用浓度。　　三、Memantine对AD模型细胞自噬作用的影响　　用药物memantine及自噬增强剂雷帕霉素处理转染APP695的细胞同时设对照组，实验分为A:NC组，B:NC+Memantine组，C:APP695组，D:APP695+memantine组，E:APP695+memantine+自噬增强剂组。吖啶橙染色，检测细胞各组细自噬小体水平。Western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表达。结果显示:与对照组相比，APP695组吖啶橙染色自噬现象明显，自噬小体增多，且Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值、Beclin-1、Atg-5均显著提高(P＜0.01);加入memantine后的APP695+memantine组自噬情况及相关蛋白的表达水平又恢复到与对照组无显著差异的水平（P＞0.05）;而加入自噬增强剂雷帕霉素的APP695+memantine+自噬增强剂组自噬情况及自噬相关蛋白的表达水平又显著提高(P＜0.01)。　　四、Memantine对AD模型抗细胞凋亡作用与自噬的关系　　用药物memantine及自噬增强剂雷帕霉素处理转染APP695的细胞同时设对照组，实验分为A: NC组，B:NC+Memantine组，C:APP695组，D:APP695+memantine组， E:APP695+memantine+自噬增强剂组。AnnexinV-APC/7-AAD染色后经流式细胞仪进行凋亡检测。同时Western blot检测各组细胞中凋亡蛋白Caspase-3的表达。结果显示:与对照组相比，NC+memantine组仅有少量的细胞凋亡（P＞0.05），APP695组的凋亡率显著提高(P＜0.01)。Memantine处理后APP695转染细胞的凋亡率下降(P＜0.01);经memantine及自噬增强剂共同处理后，细胞的凋亡率明显升高（P＜0.01），接近于APP695无药物处理组。Western blot结果显示APP695组与memantine及自噬增强剂共同处理组Caspase-3的表达量最高。而与该两者相比，memantine处理后Caspase-3的表达明显降低。　　五、 Memantine影响AD模型细胞自噬的机制　　药物memantine处理转染APP695质粒组细胞及对照组细胞，实验分为A: NC组，B:NC+memantine组，C:APP695组，D: APP695+ memantine组。Western blot检测各组细胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1、JNK1蛋白的表达。免疫荧光单染和双染检测Bcl-2和Beclin-1的定位，并用共聚焦显微镜观察结果。结果显示:与NC组细胞相比，APP695组细胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表达明显降低(P＜0.01)，memantine的加入可以明显上调这3种蛋白的表达;同时APP695组细胞中提高自噬作用的JNK1、Beclin-1蛋白的表达提高、而抑制自噬的Bcl-2的表达降低(P＜0.01)，免疫荧光双染也显示Bcl-2与Beclin-1共同定位明显降低。而上述这三种蛋白的表达量在memantine处理AD模型细胞后均发生了逆转。以上实验结果说明memantine通过上调细胞中自噬信号通路PI3K-Akt-mTOR和下调JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1复合物来调控细胞的自噬功能。　　结论:　　1、Memantine呈浓度依赖性的提高AD模型细胞的存活率，5μM为memantine对AD模型细胞的最佳使用浓度。　　2、在AD模型细胞中细胞的自噬作用是促进凋亡的。　　3、Memantine能抑制AD模型细胞的自噬作用。　　4、Memantine可抑制AD模型细胞凋亡，其抗凋亡能力与降低Caspase-3的表达水平有关。而且memantine的抗凋亡作用要通过抑制细胞的自噬作用来实现。　　5、AD模型细胞中PI3K-Akt-mTOR信号通路被抑制，JNK1促进了Bcl-2与Beclin-1分离。　　6、Memantine能通过活化PI3K-Akt-mTOR信号通路来抑制AD模型细胞的自噬作用。　　7、Memantine也能通过抑制JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1复合物来抑制AD模型细胞的自噬作用。