原发性肝细胞癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，尤其是非洲撒哈拉以南及亚洲太平洋沿岸地区的发病明显高于其他地区。在中国，每年有14万人死于肝癌，占全部恶性肿瘤死亡的18.8％，仅次于胃癌，居第2位。肝癌5年生存率仅为3％，在所有肿瘤中是最低的。我国肝癌死亡人数占全球的40％左右，居各国肝癌死亡率之首。过去30年中，尽管综合应用手术、放化疗等多种治疗手段，患者生存率提高并不多，探索新的治疗方法势在必行。 理想的治疗方式应当是既能够清除机体内多发性的肿瘤病灶，又能够特异性地区分肿瘤细胞与正常细胞。免疫治疗由于具备上述特点，成为一种具有吸引力的治疗方法。另外，免疫治疗具有记忆性，能够长时间保持对靶细胞的反应性，使用肝癌疫苗对于肝癌转移治疗具有高效性和特异性，可以长时间的防止肿瘤复发，延长患者生命。当前免疫治疗已在肝癌治疗中占据越来越重要的地位，抗原肽疫苗更是免疫治疗发展的重中之重。 T细胞在抗肿瘤免疫反应中起着关键作用。肿瘤抗原肽是肿瘤抗原经过抗原递呈细胞（APC）加工后，由HLA分子递呈给T细胞抗原受体（TCR）的短肽，是肿瘤激发机体特异性免疫反应的物质基础。肿瘤抗原肽的研究不仅对阐明免疫应答的机理和肿瘤免疫逃避机制具有十分重要的理论意义，而且对肿瘤的发病学、诊断、治疗以及疫苗制备都具有重要的应用意义，是当今国际肿瘤免疫学研究的一个热点，也是一个难点。鉴定抗原肽的方法主要有CTL扫描cDNA文库法，生物 第四军医大学博士论文专用纸＊ 化学法（包括酸洗脱．质谱法）和反向免疫法。 质谱技术应用于蛋白质研究是九十年代分子生物学的重大进展，它不仅可以 精确测定蛋白质的分子量（误差＜0刀1W，而且可以直接进行测序，具有时间短、 不受末端是否封闭及是否经过翻译后修饰等的限制，特别适用于微量样品研究 （Anol级X 成为蛋白质组研究的两大支撑技术之一。将毛细管电泳④E）或高效液 相色谱仪（HPLC）与电离子喷雾串联质谱瞩SI－MS－MS）联用，可以实现多肽混合样 品的在线分离测序，使抗原肽的大规模筛选成为可能，因此在抗原抗原肽研究中 应用越来越多。 本研究试图通过应用酸洗脱．质谱法鉴定HLA相关抗原肽，为发展肝癌特异 性疫苗奠定基础。 我们首先对肝癌细胞系HHCC、SMMC7721、9204、HepGZ进行HLA二类分 子配型，再使用IFN－Y刺激4株肝癌细胞系表达HLA分子，应用流式细胞仪检 测HLA－I类分子表达情况，选择高表达HLA－I类分子的细胞系作为研究对象，接 着大规模培养肿瘤细胞，应用柠檬酸缓冲液洗脱细胞表面HLA－I类分子结合的抗 原肽，Sephadex G25柱脱盐并初步分离抗原肽，p－HPLC进一步洗脱分离抗原肽。 应用HLA·AZ阳性志愿者外周血与所用肿瘤细胞混合培养，诱导肿瘤特异性CTL。 洗脱的抗原肽与TZ细胞进行抗原肽重建，流式细胞仪检测HLA·I类分子表达情 况，再应用肿瘤特异性CTL杀伤肽负荷TZ细胞，检测CTL识别能力。HJPLC－MS 联用初步鉴定能够被CTL识别的抗原肽重建多肽组分，MS／MS测序目标离子峰。 对于无法确定残基是亮氨酸／异亮氨酸，采用下列方法确定：l）因特网氢基酸同永 源性序列检索，根据检索结果确定残基序列；2）仍然无法确定的序列（如氨基酸 突变），则根据多肽峰的位置，RP－HPLC收集该峰，经过13轮纯化，证实为单一 物质后，多肽测序仪测序八西安美联公司、北京赛百盛公司和上海生化所均接收 样品测序）：3）无法进行多肽测序仪测序的样品州－末端封闭或量不够），对干赖 氨酸／谷氨酚胺进行多肽样品乙酚化处理，再液质联用进行测序。4）对于亮氨酸／ 异亮氨酸，根据遗传密码简并性合成多条可能的引物，利用PCR进行单链多态一 第6页共6页 第四军医大学博士论文专用纸． 致性序列分析法确定mRNA序列，推导出氨基酸残基。 应用多肽合成仪合成己测序的候选多肽，TZ负荷多肽刺激PBMC诱导特异 性CTL，流式细胞仪检测CTL表型，4h5℃r杀伤实验检测杀伤肿瘤细胞活性， 单克隆抗体封闭实验检测杀伤是否由HLA刁类分子介导。通过上述步骤检验候选． 多肽的抗原性。RT－PCR分析肿瘤抗原表达情况，对于克隆的cDNA进行测序。 最后，应用DC负荷抗原肽体外诱导肝癌特异性CTL，进行体外DC负荷抗原肽 疫苗的研究。 结果 四株细胞系均为 HLA－AZ阳性，其中 HHCC表型?